このプロトコルは、嫌気性微生物叢の呼吸測定を使用してメタン生成と微生物動態パラメータを決定するためのベストプラクティスを説明しています 食品廃棄物と廃棄物活性汚泥を共消化する。
微生物叢のバイオキネティクスを研究するための呼吸測定法の使用、廃水の処理、または廃水汚泥の消化は、過去数十年にわたってより一般的になっています。嫌気性微生物叢のバイオキネティクスを調べるための呼吸測定の使用は、廃水、汚泥、食品廃棄物などの有機廃棄物の流れを共消化する分野であり、活発な研究の分野です。今日まで、このトピックに関する視覚化されたプロトコルは公開されていません。したがって、このプロトコルでは、3つの異なる食品対微生物(F:M)比と生ごみ廃棄物および廃棄物活性汚泥を基材として使用して、メタン生成と経時的な流量を測定する呼吸計を構成しました。得られたデータは、基質利用測定と相まって、嫌気性微生物叢がメタンを生成する速度にさまざまな基質濃度がどのように影響するかを理解するための基礎を提供します。さらに、このプロトコルは、バイオキネティックパラメータ(例えば、メタン生成速度定数および収率)を開発する方法を提示する。また、この呼吸器測定プロトコルを使用して、嫌気性条件下での有機分解を調べ、微生物パラメータを開発できる人もいます。
研究者は、バッチ研究、マイクロコズム、呼吸測定など、さまざまなアプローチを使用して、ベンチスケールで微生物活動を研究しています。レスピロメーターは、制御された条件下で基質の消費と最終製品の生産を観察することにより、微生物群集の成長期および/または崩壊期を通じて細胞呼吸を測定するために使用できます1。ベンチスケールの呼吸計研究の結果は、プロセスモデル構築のための生体動態パラメータの推定にも使用できます2。呼吸計は、好気性微生物と嫌気性微生物の両方の活動を調べるために使用されてきました。しかし、特に混合有機基質のバイオメタン電位(BMP)を測定するために呼吸測定法を使用した研究は、進行中の研究分野です3,4。
生活排水中の有機物は、実行可能な再生可能な化学エネルギー源として認識されています5。廃水汚泥(すなわち、一次汚泥および廃棄物活性汚泥、WAS)の嫌気性消化は、1世紀以上にわたって廃水処理プラント(WWTP)でメタンに富むバイオガスを生成するために使用されてきました6。しかし、WASによる生ごみ廃棄物など、複数の有機廃棄物の流れの消化は近年になってようやく普及し、依然として活発な研究分野です。生ごみ廃棄物は、多くの先進国で高密度有機材料の一貫した廃棄物の流れであり、米国の埋立地質量の約25%を占めています7。生ごみの一部を埋め立て地への処分から転用するだけでなく、共消化シナリオでの生ごみとWASの組み合わせは、生成されるバイオガスの量が増加するため(単一の有機廃棄物の流れと比較して)有利です。バイオガスには、通常、60%〜70%のメタン、30〜40%の二酸化炭素、および微量の他のガス(硫化水素など)が含まれています8。バイオガスは、熱電併給技術を使用してWWTPの現場で洗浄および燃焼させ、電気および熱エネルギー要件の一部を相殺することができます9。
いくつかの研究では、有機廃棄物を共消化する嫌気性微生物叢のバイオメタネーションの可能性と生体動態パラメータが調査されています1。文献で利用可能な研究では、実験全体の離散的なポイントでメタン生成が測定される血清ボトルでのバッチアッセイが使用されていましたが、他の研究では、ベンチスケールまたはパイロットスケールのバイオリアクター2,10,11に直接接続された流量計を使用してメタン生成が測定されました。このプロトコルに記載されているような呼吸計を使用したメタン生成の連続測定は、さまざまな実験条件下で実行される多数のサンプルからの連続的かつ正確なメタン測定を提供できます1,12。いくつかの研究では、WASと他の有機基質(バイオ廃棄物、脂肪、油脂、グリース、農業廃棄物10,13,14)と結合した共消化によるメタン生成が測定されているが、多種多様な共消化シナリオからメタン生成速度を特定するための重要な研究が残っている。さらに、これまでのところ、食品スクラップとWASの共消化からのメタン生成を測定するための視覚的描写を使用した詳細で段階的なアプローチを提供する利用可能なプロトコルはありません。したがって、この研究では、希薄廃水、WAS、および食品廃棄物を基質として混合して、メタン生成を測定し、生体動態パラメータを導き出すための呼吸計プロトコルを提示します。メタン生産の変化を解明するために、さまざまな食品と微生物の比率(F:M)が使用されました。その他の測定値には、揮発性浮遊物質(VSS)、化学的酸素要求量(COD)、および各サンプルのpHが含まれます。このプロトコルでは、呼吸計のセットアップ、サンプルの作成、および重要な測定について説明します。
このプロトコルで提供される方法は、研究者や開業医が呼吸測定を使用して有機廃棄物の流れを嫌気的に消化するバイオメタンの可能性を判断するのに役立ちます。このプロトコルでは、典型的な食品廃棄物の流れとWWTPからのWASを組み合わせた共消化によるメタン生成を、さまざまなF:M比で実証します。このプロトコルは、メタン生成の連続測定と一次動力学モデリングを使用した生体動態パラメータの決定のための段階的な呼吸測定アプローチを提供することにより、文献に追加されます。他のいくつかの研究では、離散的な時間10,22でのメタン生成を測定する小宇宙実験が採用されており、他の研究では、長時間連続フローベンチまたはパイロットスケールのバイオリアクター14,23に取り付けられた流量計を使用してメタンを測定しています。呼吸器測定には、さまざまな実験条件でメタン生成を連続的に測定できるという利点があります。呼吸器計測実験ではバイオリアクターの構築を必要としないため、実験条件は、一部のベンチスケールまたはパイロットスケールの実験と比較して、相対的な頻度で変更することができます。この利点により、呼吸測定実験を使用して、比較的短時間で多数の有機廃棄物の組み合わせを共消化することにより、メタン生成を決定できます。例えば、この研究で提示されたプロトコルの次のステップとして、WASに比べて化学エネルギーが非常に高い油脂、油脂、グリースを食品スクラップと一緒に消化して、時間の経過とともにメタン生成が増加する可能性を定量化することができます。このアプローチの適用は、共消化スキームにおける複数の基質の組み合わせにわたるメタン生成速度と生体動態パラメータに関する一連の文献を引き続き構築することができます。さらに、最適な基質の組み合わせを決定するだけでなく、メタン生成結果と生体動態パラメータを使用して、廃水処理用に設計されたプログラムなどの既存のプログラムのパフォーマンスモデリングに情報を提供したり、ベンチスケールまたはパイロットスケールからフルスケールにスケールアップしたときに共消化スキームがどのように機能するかを予測したりできます24,25。
さらに、このプロトコルは、嫌気性微生物コンソーシアムに合わせた基質フィードを適用するように修正される可能性があります。例えば、研究者が嫌気性微生物叢に炭水化物のみまたはタンパク質のみを提供することの影響を調べたい場合、このプロトコルの原料はそれに応じて変更することができます。あるいは、研究者が特定の画分COD(例えば、可溶性CODのみ、または微粒子CODのみ)または高濃度の特定の基質(例えば、酢酸塩、揮発性脂肪酸、嫌気性代謝の中間生成物)をメタン生成に添加することの影響をテストしたい場合は、このプロトコルのバリエーションを使用することができます。基質を改質したり、特定の基質のF:Mを交互にしたりする際に観察されるベストプラクティスは、各サンプルの嫌気性微生物叢の質量を同じに保ちながら、基質の質量のみを調整することです(質量対質量比を採用する必要があります)。研究者は、基質の改質に加えて、このプロトコルを他の分析と併用して、基質の使用とメタン生成について理解を深めることができます。例えば、研究者は、このプロトコルを微生物群集解析(16S rRNA遺伝子シーケンシングやメタゲノミクスなど)と組み合わせて使用することで、群集構造と機能をよりよく関連付けることができます。
この方法論の有用性にもかかわらず、いくつかの制限があります。呼吸計とバイオメタン電位試験は、バッチリアクターとして最も頻繁に構成されます。ただし、フルスケールの嫌気性共消化器は、通常、スラッジ保持時間が10日を超える連続フローシステムとして運用されます1。したがって、呼吸器計測実験から収集されたデータは、メタン生成速度の推定や生体動態パラメータの開発に役立ちますが、これらのデータは、可能であれば、長期にわたって動作する大規模な消化器を使用して現場で検証する必要があります。
さらに、呼吸測定の前にサンプルを選択して準備する際には注意を払う必要があります。大きな生ごみ粒子は、VSSおよびCOD測定を歪め、不正確な結果をもたらす可能性があります。食品廃棄物を基材として使用する場合、ブレンドは十分に浸軟し、大きな食品粒子を含まない必要があります-これは、フルスケールの消化槽で食品廃棄物を受け入れるピットでのマセラシオンに似たアプローチです。脱イオン水による希釈は、ブレンドプロセスに役立ち、生ごみを大規模に浸軟させるときに一般的に使用される水の追加と似ています。ただし、希釈が適切に測定され、目標水分含有量が達成されるように、あらゆる努力を払う必要があります。希釈化は、特に経験の浅い学生がこのプロトコルを実行している場合、エラーの原因になりやすいです。
共消化に存在する微生物コンソーシアムには偏性嫌気性菌が含まれているため、移送およびサンプル調製プロセス中の酸素への曝露を排除(または大幅に低減)するために特別な注意を払う必要があります。酸素は、窒素フラッシングによってサンプルボトルから除去できます。さらに、可能であれば、収集ボトルと呼吸計サンプルボトルの間で嫌気性培養を移す作業は、嫌気性チャンバーで行う必要があります。呼吸計は一貫した結果(メタン生成量と速度)を提供するため、期待される結果からの逸脱、例えば生存不可能な微生物コンソーシアムは、テストの開始に向けて簡単に特定できます。重複または三重のサンプルを使用すると、欠陥のあるテストの特定にさらに役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
このプロトコルの開発に関する議論にご協力いただいたRespirometer Systems and ApplicationsのJim Young博士に感謝いたします。
103 °C Oven Isotemp | Fisher Scientific | 13-247-737F | Model: 737F, Force Air Oven |
550 °C Vulcan Oven | Neytech (Manufacturer) / Cole Palmer (Vendor) | 9493308 | Model: 3-550 |
Aerobic/Anaerobic Respirometer | Respirometer System and Applications (RSA) | PF-8000 | Model: PF-8000 |
Analytical Balance | Mettler Toledo | 30029075 | Model: ME204E, Detection Limit: 0.1 mg |
Smoothie Blender with 56 oz Plastic Jar | Hamilton Beach | 50190F | Model: 50190F |
COD Vials TNT Plus Vial Test | HACH | TNT821 | TNT 821, 3–150 mg/L COD |
COD Vials TNT Plus Vial Test | HACH | TNT822 | TNT 822, 20–1500 mg/L COD |
Dessicator | SP Bel-Art | 942070050 | Model: SP Scienceware |
Dionized Water System | Milli-Q | ZIQ7010T0C | IQ 7010 Pure & Ultrapure Water Purification System |
Anhydrous CaSO4 | W.A. Hammond Drierite Company | 13001 | 8 Mesh, 1 lb |
Glass Fiber Filters | Whatman (Manufacturer) / Cole-Parmer (Vendor) | 1827-150 | Model: 934-AH |
Heat Digestor Block | HACH | DRB200-02 | DRB 200 |
Hot Plate Stirrer | Corning | 6795-620D | Model: PC-620D |
Industrial-Grade Nitrogen (Compressed Cylinder) | Air Gas | NI UHP300 | 300 cubic feet |
Pellets (KOH) | Fisher Scientific | AC134062500 | 500 g |
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AP115 | AP115, Accumet pH meter |
UV Spectrophotometer | HACH | LPV400.99.00012 | DR 3900 |
Vaccum Pump | GAST | 1HAB-25-M100X |