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Environment

Misurazione del potenziale di biometano dei rifiuti di scarto alimentare co-digeriti anaerobicamente con fanghi attivati dai rifiuti mediante respirometria

Published: April 26, 2024
doi:
10.3791/66485
, , , , , , ,
1Department of Geography and Environmental Engineering,United States Military Academy

Summary

Questo protocollo descrive una best practice per determinare la produzione di metano e i parametri cinetici microbici utilizzando la respirometria per il microbiota anaerobico che co-digerisce gli scarti alimentari e i fanghi attivi di scarto.

Abstract

L’uso della respirometria per studiare la biocinetica del microbiota che tratta le acque reflue o digerisce i fanghi delle acque reflue è diventato più diffuso negli ultimi decenni. L’uso della respirometria per esaminare la biocinetica del microbiota anaerobico che co-digerisce flussi di rifiuti organici come acque reflue, fanghi e scarti alimentari è un’area di ricerca attiva. Ad oggi, non è stato pubblicato alcun protocollo visualizzato sull’argomento. Di conseguenza, in questo protocollo, abbiamo configurato un respirometro per misurare la produzione di metano e la portata nel tempo utilizzando tre diversi rapporti cibo-microrganismo (F:M) e scarti alimentari e fanghi attivi come substrati. I dati risultanti, insieme alle misurazioni dell’utilizzo del substrato, forniscono la base per comprendere come le diverse concentrazioni di substrato influenzino la velocità con cui il microbiota anaerobico produce metano. Inoltre, questo protocollo presenta un metodo per sviluppare parametri biocinetici (ad esempio, costante del tasso di produzione di metano e resa). Altri possono utilizzare questo protocollo di respirometria per esaminare la degradazione organica in condizioni anaerobiche e sviluppare parametri microbici.

Introduction

I ricercatori studiano l’attività microbica su scala di banco utilizzando una varietà di approcci, tra cui studi in batch, microcosmi e respirometria, tra gli altri. I respirometri possono essere utilizzati per misurare la respirazione cellulare attraverso le fasi di crescita e/o decadimento di una comunità microbica, osservando il consumo di substrato e la produzione di prodotti finali in condizioni controllate1. I risultati degli studi con respirometro su scala da banco possono essere utilizzati anche per stimare i parametri biocinetici per la costruzione del modello di processo2. I respirometri sono stati utilizzati per esaminare l’attività microbica sia aerobica che anaerobica; tuttavia, gli studi che utilizzano la respirometria per misurare il potenziale del biometano (BMP), in particolare di substrati organici misti, sono un’area di ricerca in corso 3,4.

I prodotti organici nelle acque reflue domestiche sono riconosciuti come una valida fonte rinnovabile di energia chimica5. La digestione anaerobica dei fanghi di acque reflue (ad esempio, fanghi primari e fanghi attivati dai rifiuti, WAS) è stata utilizzata per produrre biogas ricco di metano negli impianti di trattamento delle acque reflue (WWTP) per oltre un secolo6. Tuttavia, la digestione di più flussi di rifiuti organici, come i rifiuti di scarto alimentare con WAS, è diventata prevalente solo negli ultimi anni ed è ancora un’area di ricerca attiva. I rifiuti di scarto alimentare sono un flusso costante di materiale organico ad alta densità in molti paesi sviluppati, che rappresenta circa il 25% della massa delle discariche negli Stati Uniti7. Oltre a deviare una parte degli scarti alimentari dallo smaltimento in discarica, la combinazione di scarti alimentari e WAS in uno scenario di co-digestione è vantaggiosa a causa dell’aumento del volume di biogas prodotto (rispetto a un singolo flusso di rifiuti organici). Il biogas contiene in genere il 60%-70% di metano, il 30%-40% di anidride carbonica e tracce di altri gas (ad esempio, idrogeno solforato)8. Il biogas può essere depurato e bruciato in loco presso gli impianti di depurazione utilizzando una tecnologia di cogenerazione di calore ed energia per compensare parte del fabbisogno di energia elettrica e termica9.

Diversi studi hanno esaminato il potenziale di biometanazione e i parametri biocinetici del microbiota anaerobico che co-digerisce i rifiuti organici1. Gli studi disponibili in letteratura hanno utilizzato saggi batch in flaconi di siero in cui la produzione di metano viene misurata in punti discreti durante l’esperimento, mentre altri hanno misurato la produzione di metano utilizzando flussimetri collegati direttamente a bioreattori da banco o su scala pilota 2,10,11. La misurazione continua della produzione di metano mediante un respirometro, come quello descritto in questo protocollo, può fornire misurazioni continue e precise del metano da un gran numero di campioni eseguiti in una varietà di condizioni sperimentali 1,12. Sebbene diversi studi abbiano misurato la produzione di metano dalla co-digestione di WAS accoppiato con altri substrati organici, come rifiuti organici, grassi, oli, grassi e rifiuti agricoli 10,13,14, rimane ancora molto lavoro da fare per identificare i tassi di produzione di metano dalla grande varietà di scenari di co-digestione. Inoltre, ad oggi, nessun protocollo disponibile fornisce un approccio approfondito e graduale che utilizza rappresentazioni visive per la misurazione della produzione di metano dalla co-digestione di scarti alimentari e WAS. Di conseguenza, questo studio presenta un protocollo respirometrico per misurare la produzione di metano e derivare parametri biocinetici utilizzando come substrati una miscela di acque reflue diluite, WAS e scarti alimentari. Diversi rapporti cibo/microrganismi (F:M) sono stati utilizzati per aiutare a chiarire i cambiamenti nella produzione di metano. Altre misure includono i solidi sospesi volatili (VSS), la domanda chimica di ossigeno (COD) e il pH di ciascun campione. Questo protocollo descrive la configurazione del respirometro, la creazione del campione e le misurazioni critiche.

Protocol

1. Preparazione del substrato Raccogliere ~1,5 L di effluente primario, ~1 L di fanghi attivi di scarto (WAS).NOTA: I campioni di WAS devono essere prelevati immediatamente prima dell’esperimento; tuttavia, WAS può essere conservato per un massimo di 48 ore a 4 °C prima dell’esperimento senza alcun impatto percepibile sul suo utilizzo come substrato 15,16,17. Acquisire 2 L di coltura anaerobica immediatamente prima dell’esperimento e mantenere la coltura a 35 °C. Limitare il più possibile il contatto con l’aria durante il trasferimento dal digestore anaerobico alla bottiglia di raccolta.NOTA: La coltura anaerobica utilizzata in questo studio è stata ottenuta da un impianto di depurazione che ha trattato 8,5 MGD (38.640 m3/d) con digestione anaerobica dei fanghi primari delle acque reflue. Una buona pratica consiste nel mantenere le condizioni anaerobiche lavando la bottiglia di raccolta con azoto gassoso prima di acquisire una coltura anaerobica13 e mantenendo le condizioni anaerobiche durante il trasporto e lo stoccaggio. Raccogliere i rifiuti alimentari e conservarli fino a 48 ore prima dell’esperimento a 4 °C.NOTA: a seconda del disegno sperimentale, occorre prestare attenzione a identificare gli sprechi alimentari con le proporzioni target di carboidrati, proteine, ecc. Le proporzioni target di sostanze organiche nei rifiuti alimentari varieranno probabilmente in base all’esperimento. La frazione di carboidrati, proteine e grassi nel cibo raccolto può essere stimata dalla letteratura pubblicata o valutata utilizzando protocolli stabiliti (ad esempio, gascromatografia). 2. Preparazione di integratori nutritivi Preparare la soluzione di base minerale #1 mescolando 800 mL di acqua deionizzata (DI) con CoCl2·6H2O (0,25 g), FeCl3·6H2Ø (5 g), MnCl2·4H2O (0,05 g), NaMoO4·2H2Ø (0,005 g), NiCl2·6H2Ø (0,025 g), CuCl2·2H2O (0,007 g), ZnCl2 (0,025 g), H3BO3 (0,025 g) e Na2SeO4 (0,025 g). Diluire fino a 1 L con acqua deionizzata (DI). Preparare la soluzione base minerale #2 mescolando 800 ml di acqua deionizzata con CaCl2 (27,7 g) e MgCl2·4H2O (101 g). Diluire fino a 1 L con acqua deionizzata. Preparare una base nutritiva mescolando 800 ml di acqua deionizzata con NH4Cl (38,2 g) e Na2SO4 (15 g). Regolare il pH a 7,0 utilizzando 3,64 N di NaOH in acqua deionizzata e diluire fino a 1 L con acqua deionizzata. 3. Preparazione del campione Unire i rifiuti alimentari (Tabella 2) in un frullatore (Figura 1) per creare una miscela. Assicurarsi che la miscela sia priva di grandi particelle di rifiuti alimentari. Diluire i rifiuti alimentari con acqua deionizzata per facilitare la miscelazione. Annotare la quantità di acqua di diluizione da utilizzare per il calcolo delle misure della domanda chimica di ossigeno (COD). Questi rifiuti alimentari diluiti sono noti come “rifiuti di lavoro”. Mettere i rifiuti di lavoro in una bottiglia di plastica da 1 litro e conservarla a 4 °C. Etichettare quattro bicchieri da 2 L secondo la Tabella 1. Posizionare i bicchieri su una piastra di agitazione e aggiungere una grande barra di agitazione. Combinare i rifiuti alimentari, il WAS e la diluizione (acqua deionizzata per il controllo e l’effluente primario per i trattamenti) secondo la Tabella 1 nei becher da 2 L. Aggiungere 12 ml ciascuno di soluzione di base minerale #1, soluzione di base minerale #2 e base nutritiva. Aggiungere 2,4 g di NaHCO3 (polvere) in ogni bicchiere e mescolare per 30 s. Etichettare otto flaconi per respirometria secondo la Tabella 1 e aggiungere un’ancoretta magnetica.NOTA: Questo creerà duplicati del controllo e tre trattamenti con diversi rapporti F:M. Aggiungere la coltura anaerobica a ciascun becher da 2 L secondo la Tabella 1 e mescolare. Misurare immediatamente 500 ml di miscela dal becher con un cilindro graduato e trasferirla in un flacone per respirometro etichettato, sciacquare con azoto gassoso, quindi tappare immediatamente.NOTA: Prestare attenzione a limitare il contatto del microbiota anaerobico con l’ossigeno atmosferico (se disponibile, per il trasferimento è necessario utilizzare una camera anaerobica). 4. Quantificazione delle condizioni iniziali Utilizzare il campione rimanente della sezione 3 (~200 mL) per misurare il pH, il COD totale (tCOD), il COD solubile (sCOD), i solidi sospesi totali (TSS) e i solidi sospesi volatili (VSS) per ogni campione18.Se necessario, diluire i campioni con acqua deionizzata in base ai limiti di rilevamento dell’apparecchiatura di misurazione.NOTA: Per le misurazioni COD sono state utilizzate le procedure del produttore. 5. Configurazione del respirometro Impostare il respirometro (Figura 2) sull’impostazione anaerobica bassa. Premere contemporaneamente il pulsante di ripristino e il pulsante di accensione.NOTA: Questo è specifico per il modello utilizzato in questo studio. Impostare il refrigeratore (Figura 3) a 35,5 °C. Riempire ogni scrubber di CO2 e umidità (Figura 4 e Figura 5) con una miscela 50/50 di pellet CaSO4 e KOH al centro, circondata da lana di vetro su ciascun lato. Collegare i tubi e gli aghi dai flaconi del campione allo scrubber e quindi dallo scrubber all’ingresso del gas (Figura 6). Sul portatile respirometro, eseguire il programma respirometro RSA-8-v2.0.NOTA: questo passaggio è specifico per il modello utilizzato in questo studio. Seleziona tutte le bottiglie nel programma e seleziona Modifica > etichette dati. Assegna un nome a tutte le bottiglie.NOTA: questo passaggio è specifico per il modello utilizzato in questo studio. Iniziare a misurare la produzione di gas attivando il pulsante di avvio nel programma. Impostare il programma per misurare i dati alla fine di ogni mezz’ora. Monitora la produzione di gas selezionando Grafico delle tariffe o Grafico dei volumi.NOTA: questo passaggio è specifico per il modello utilizzato in questo studio. Dopo l’esperimento (~7 giorni), interrompere l’esecuzione nel programma, spegnere il refrigeratore e spegnere il modulo RSPF. Salva il file di dati come file CSV, quindi convertilo in un documento MS Excel.NOTA: questo passaggio è specifico per il modello utilizzato in questo studio. 6. Misurazioni post-respirazione Misurare pH, TSS, VSS e COD sui campioni finali come fatto nella sezione 4.

Representative Results

Composizione dei rifiuti alimentariI rifiuti alimentari utilizzati in questo studio consistevano in cinque diversi tipi di cibo tipicamente serviti in una mensa universitaria. Ogni campione di cibo aveva quantità variabili di grassi, carboidrati e proteine, elencati nella Tabella 2. 19 Gli scarti alimentari miscelati erano il 44% di carboidrati, il 36% di proteine, il 16% di grassi e il 4% di altri materiali. Una massa approssimativamente uguale di ciascun tipo di alimento (da 56 g a 86 g) è stata utilizzata per fornire un substrato organico rappresentativo per la co-digestione anaerobica. La massa dei rifiuti di scarto alimentare è stata successivamente variata per ottenere l’F:M desiderato per ogni scenario esaminato (0,3, 0,7 e 1,1). Misure di solidi sospesi volatili e organiciI risultati per il VSS iniziale e finale e la domanda iniziale e finale di ossigeno si trovano nella Tabella 3. La domanda di ossigeno è presentata come BOD5, che è stato convertito dal COD utilizzando il rapporto di conversione accettato (COD = 1,6BOD5)8. Come mostrato, le concentrazioni iniziali di VSS (rappresentate anche dalla massa nella Tabella 3) sono aumentate dal controllo al massimo rapporto F:M (1,1). Ogni F:M esaminato ha mostrato la distruzione VSS, o conversione anaerobica di sostanze organiche in prodotti finali gassosi di metano e anidride carbonica. A causa della conversione, la concentrazione di VSS è diminuita dalle misurazioni iniziali alle misurazioni finali effettuate alla fine dell’esperimento. La quantità di VSS distrutta è aumentata dal controllo a rapporti F:M più grandi. Inaspettatamente, la distruzione VSS per lo scenario F:M = 0,7 ha superato lo scenario F:M = 1,1, forse a causa dell’inibizione nello scenario F:M di 1,1. Le concentrazioni iniziali misurate della domanda di ossigeno hanno seguito lo stesso andamento del VSS, cioè sono aumentate dal controllo al massimo rapporto F:M (Tabella 3). Analogamente alla distruzione VSS, le concentrazioni di BOD5 diminuiscono tra le concentrazioni iniziali e finali, ad eccezione del controllo. La richiesta di ossigeno è aumentata nel controllo, probabilmente a causa del decadimento endogeno. A differenza della distruzione VSS, la riduzione della domanda di ossigeno dalla misurazione iniziale a quella finale è stata relativamente bassa per ciascun campione, compresa tra l’1 e il 3%, e non ha mostrato alcuna tendenza per rapporto F:M. Una possibile ragione di questa tendenza è la conversione della materia organica particellare in sostanze organiche solubili, che avviene su lunghi periodi di tempo ed è spesso un passaggio limitante nel metabolismo dei consorzi microbici anaerobici20. Produzione di metanoLe quantità e i tassi di produzione di metano variavano nell’intervallo dei rapporti F/M durante il periodo di studio di 190 ore. I risultati sperimentali hanno rivelato che rapporti F/M più elevati hanno prodotto un aumento dei volumi complessivi di metano (Figura 7). Il controllo, al quale non è stato aggiunto alcun substrato, ha prodotto una piccola quantità di metano (~72 mL) probabilmente a causa della quantità relativamente piccola di BOD5 solubile nei fanghi e/o del decadimento endogeno. Come anticipato, l’aggiunta di substrato in altri scenari ha aumentato la produzione di metano rispetto al controllo. Lo scenario F:M di 0,3 ha prodotto cinque volte più metano, in volume (~354 mL), rispetto al controllo. L’aumento del rapporto F:M a 0,7 ha prodotto una quantità di metano 1,6 volte superiore (~574 mL) rispetto allo scenario F:M di 0,3. Allo stesso modo, l’aumento del rapporto F:M a 1,1 ha prodotto una quantità di metano 1,9 volte superiore (~1098 mL) rispetto allo scenario F:M di 0,7. I valori massimi di produzione volumetrica di metano osservati (Ymax) per ciascun rapporto F:M esaminato sono riportati nella tabella 4. Anche il tasso di metano prodotto nel tempo è cambiato con i rapporti F/M esaminati. Come mostrato nella Figura 8, il tasso di produzione di metano, così come il periodo di tempo durante lo studio in cui il metano è stato prodotto, sono aumentati all’aumentare dell’F:M. Ad esempio, nello scenario F:M di 0,3, non è stata osservata alcuna produzione di metano dopo 129 ore di studio (con un massimo di 354 mL), mentre lo scenario F:M di 1,1 produceva ancora una piccola quantità di metano alla fine dello studio. In tutti gli scenari, il tasso di metano prodotto è diminuito nel tempo a causa della ridotta disponibilità del substrato. Sebbene alla fine dello studio fosse ancora disponibile un’abbondante domanda di ossigeno (Tabella 3), potrebbe non essere stata in forma biodisponibile, o potrebbe esserci stato un numero limitato di accettori di elettroni rimanenti (ad esempio, anidride carbonica) per il microbiota anaerobico. Infine, un confronto tra il metano prodotto (mL) per VSS distrutto (mg) osservato mostra che i valori di F:M di 0,3 e 0,7 fornivano un intervallo compreso tra 1,3 e 1,6 mL/mg, mentre il F:M di 1,1 produceva più metano per unità di VSS distrutto (3,7 mL/mg) (Tabella 4). Tchobanoglous et al. (2014) fornisce intervalli tipici per la resa di gas per unità di solidi distrutti per le materie prime comuni, per includere grassi (~1,4 mL/mg), grassi (~1,1 mL/mg) e proteine (~0,7 mL/mg)8. Mata-Alvarez et al. (2014) hanno esaminato gli studi sulla co-digestione dei fanghi di acque reflue con una varietà di substrati e diversi rapporti di substrato (ad esempio, diversi rapporti di WAS e FOG), in bioreattori su scala da banco e su scala pilota10. Hanno scoperto che la produzione di metano riportata per unità VSS distrutta variava sostanzialmente con i substrati co-digeriti, così come il rapporto tra i substrati, che variava da 0,2 mL a 1,1 mL di biogas per mg VS distrutto. I risultati rappresentativi di questo studio, in particolare per F:M di 0,3 e 0,7, si confrontano favorevolmente con i risultati degli studi di confronto. Parametri biocineticiLa produzione di metano nel tempo può essere utilizzata per determinare diversi importanti parametri biocinetici. Questi parametri biocinetici possono essere ulteriormente sfruttati per prevedere la produzione di metano in scenari simili senza l’uso del respirometro. La costante del tasso di produzione di metano, k, può essere derivata utilizzando un adattamento logaritmico dei minimi quadrati ai dati del respirometro osservati per ciascun rapporto F:M esaminato (cioè quelli mostrati nella Figura 8). Una funzione logaritmica rappresentativa per lo scenario F:M di 0,3 è y = 93,465ln(X) – 175,91. Qui, il valore di 93,465 è in unità di ore, che devono essere convertite in giorni e poi invertite, dando un k = 0,257. Le costanti di velocità (k) e il coefficiente di determinazione (R2) per ciascun rapporto F:M esaminato si trovano nella Tabella 4. La costante di velocità può quindi essere sfruttata per determinare la resa del metano in un dato momento per ciascun rapporto F:M. Il tasso di metano prodotto nel tempo dal substrato organico può essere modellato utilizzando la seguente equazione [1]21: (1) Integrando l’equazione di cui sopra tra i limiti t = 0 a t = t, si ottiene il seguente [2]: (2) Dove, Y = resa di metano in qualsiasi momento [mL]; Ymax = resa massima di metano osservata dallo studio respirometro [mL]; k = costante del tasso di produzione di metano [d-1]; t = tempo [d] Mentre l’approccio del primo ordine utilizzato per sviluppare i parametri biocinetici presentato sopra fornisce un adattamento molto ragionevole ai dati sperimentali (come indicato dai valori di R2 nella Tabella 4), altri studi hanno riportato l’uso di altri modelli per adattare i dati di produzione di metano, tra cui il modello di Gompertz modificato, il modello a due substrati e il modello a cono2. Figura 1: Frullatore per rifiuti alimentari. Frullatore standard utilizzato per combinare i rifiuti alimentari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Respirometro. Configurazione completa del respirometro per misurare la produzione di metano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Flacone del campione nel refrigeratore del respirometro. Vista interna del refrigeratore respirometro con otto bottiglie di campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Scrubber del respirometro. Vista ravvicinata dello scrubber del respirometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Scrubber del respirometro al modulo di controllo. Immagine del respirometro del modulo di controllo e configurazione dello scrubber. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Configurazione della linea di lavaggio del respirometro. Vista ravvicinata della linea di lavaggio impostata tra le bottiglie di campione e il respirometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Produzione totale di metano utilizzando diversi rapporti F:M. La produzione di metano per ogni F:M (0,3, 0,7, 1,1) è rappresentata nel tempo (da 0 h a 190 h). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Tasso di produzione di metano utilizzando diversi rapporti F:M. Il tasso di produzione di metano per ogni F:M (0,3, 0,7, 1,1) è rappresentato nel tempo (da 0 h a 190 h). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Componenti della bottiglia campione con rapporti cibo-microbi. Massa, concentrazione e volume costituenti per ogni F:M (0,3, 0,7, 1,1) e le bottiglie vuote. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Composizione del substrato organico del campione. Massa dei rifiuti alimentari e composizione percentuale per alimento e proporzione di carboidrati, proteine e grassi. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 3: Risultato della domanda di ossigeno e solido sospeso volatile del campione (deviazione standard ±). VSS e COD per ogni F:M (0,3, 0,7, 1,1). Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 4: Parametri cinetici del campione. Parametri cinetici calcolati in base alla resa di metano. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

I metodi forniti in questo protocollo possono aiutare i ricercatori e i professionisti a determinare il potenziale di biometano della digestione anaerobica dei flussi di rifiuti organici utilizzando la respirometria. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di metano dalla co-digestione di un tipico flusso di rifiuti di scarti alimentari accoppiato con WAS da un impianto di depurazione su un intervallo di rapporti F:M. Questo protocollo si aggiunge alla letteratura fornendo un approccio passo-passo alla respirometria per la misurazione continua della produzione di metano e la determinazione dei parametri biocinetici utilizzando la modellazione cinetica del primo ordine. Diversi altri studi hanno impiegato esperimenti di microcosmo che misurano la produzione di metano in punti discreti nel tempo10,22, mentre altri hanno misurato il metano utilizzando flussimetri collegati a bioreattori da banco o su scala pilota a flusso continuo a lungo funzionamento14,23. La respirometria offre il vantaggio di misurare la produzione di metano su base continua in una varietà di condizioni sperimentali. Poiché gli esperimenti di respirometria non richiedono la costruzione di un bioreattore, le condizioni sperimentali possono essere modificate con relativa frequenza rispetto ad alcuni esperimenti su scala di banco o pilota. Grazie a questo vantaggio, gli esperimenti di respirometria possono essere utilizzati per determinare la produzione di metano dalla co-digestione di numerose combinazioni di rifiuti organici in un periodo di tempo relativamente breve. Ad esempio, come passo successivo al protocollo presentato in questo studio, grassi, oli e grassi, che sono molto densi di energia chimica rispetto al WAS, potrebbero essere co-digeriti con gli avanzi di cibo per quantificare i probabili aumenti della produzione di metano nel tempo. L’applicazione di questo approccio può continuare a costruire il corpus di letteratura riguardante i tassi di generazione del metano e i parametri biocinetici in molteplici combinazioni di substrati in schemi di co-digestione. Inoltre, oltre a determinare le combinazioni ottimali di substrati, i risultati della produzione di metano e i parametri biocinetici possono essere utilizzati per informare la modellazione delle prestazioni nei programmi esistenti, come quelli progettati per il trattamento delle acque reflue, o per prevedere le prestazioni degli schemi di co-digestione quando scalati da scala di banco o pilota a scala reale24,25.

Inoltre, questo protocollo potrebbe essere modificato per applicare un mangime substrato su misura per il consorzio microbico anaerobico. Ad esempio, se un ricercatore volesse esaminare l’impatto della fornitura di soli carboidrati o solo proteine al microbiota anaerobico, la materia prima in questo protocollo potrebbe essere modificata di conseguenza. In alternativa, se un ricercatore volesse testare l’impatto dell’aggiunta di una frazione specifica di COD (ad esempio, solo COD solubile o solo COD particolato) o alte concentrazioni di un particolare substrato (ad esempio, acetato, acido grasso volatile e prodotto intermedio del metabolismo anaerobico) sulla produzione di metano, potrebbe essere utilizzata una variante di questo protocollo. Una buona pratica osservata quando si modifica il substrato o si alterna l’F:M di un particolare substrato è quella di mantenere la stessa massa di microbiota anaerobico per ogni campione, regolando solo la massa del substrato (dovrebbero essere utilizzati rapporti massa-massa). Oltre a modificare i substrati, i ricercatori possono utilizzare questo protocollo con altre analisi per ottenere una migliore comprensione dell’uso dei substrati e della produzione di metano. Ad esempio, un ricercatore potrebbe utilizzare questo protocollo in combinazione con analisi della comunità microbica (ad esempio, sequenziamento del gene 16S rRNA o metagenomica) per correlare meglio la struttura della comunità alla funzione.

Nonostante l’utilità di questa metodologia, ci sono diverse limitazioni. I respirometri e i test del potenziale del biometano sono più frequentemente configurati come reattori batch; Tuttavia, i co-digestori anaerobici su larga scala sono normalmente utilizzati come sistemi a flusso continuo con tempi di ritenzione dei fanghi superiori a 10 giorni1. Di conseguenza, i dati raccolti dagli esperimenti di respirometria sono utili per stimare i tassi di generazione di metano e sviluppare parametri biocinetici, ma questi dati dovrebbero essere convalidati sul campo utilizzando digestori su larga scala azionati nel tempo, quando possibile.

Inoltre, è necessario prestare attenzione nella selezione e nella preparazione dei campioni prima della respirometria. Le particelle di scarto alimentare di grandi dimensioni distorcono le misurazioni VSS e COD e possono fornire risultati imprecisi. Se i rifiuti di scarto alimentare vengono utilizzati come substrato, la miscela deve essere ben macerata e priva di particelle di cibo di grandi dimensioni, un approccio simile alla macerazione nei noccioli di ricezione degli scarti alimentari nei digestori su larga scala. La diluizione con acqua deionizzata può aiutare con il processo di miscelazione ed è simile all’aggiunta di acqua comunemente usata quando gli avanzi di cibo vengono macerati su larga scala. Tuttavia, è necessario fare tutto il possibile per garantire che le diluizioni siano misurate correttamente e che venga raggiunto il contenuto di umidità target. La diluizione può essere facilmente una fonte di errore, soprattutto se gli studenti inesperti eseguono questo protocollo.

Poiché i consorzi microbici esistenti nella co-digestione contengono anaerobi obbligati, è necessario prestare particolare attenzione per eliminare (o ridurre notevolmente) l’esposizione all’ossigeno durante i processi di trasferimento e preparazione del campione. L’ossigeno può essere rimosso dai flaconi dei campioni tramite lavaggio con azoto. Inoltre, se disponibile, il lavoro di trasferimento della coltura anaerobica tra le bottiglie di raccolta e le bottiglie di campioni del respirometro dovrebbe essere condotto in una camera anaerobica. Poiché il respirometro fornisce risultati coerenti (volumi e velocità di produzione di metano), qualsiasi deviazione dai risultati attesi, ad esempio un consorzio microbico non vitale, può essere facilmente identificata verso l’inizio del test. L’uso di un campione duplicato o triplicato può aiutare ulteriormente a identificare i test difettosi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Jim Young di Respirometer Systems and Applications per la discussione riguardante lo sviluppo di questo protocollo.

Materials

103 °C Oven Isotemp Fisher Scientific 13-247-737F Model: 737F, Force Air Oven
550 °C Vulcan Oven Neytech (Manufacturer) / Cole Palmer (Vendor) 9493308 Model: 3-550
Aerobic/Anaerobic Respirometer Respirometer System and Applications (RSA) PF-8000 Model: PF-8000
Analytical Balance Mettler Toledo 30029075 Model: ME204E, Detection Limit: 0.1 mg
Smoothie Blender with 56 oz Plastic Jar Hamilton Beach 50190F Model: 50190F
COD Vials TNT Plus Vial Test HACH TNT821 TNT 821, 3–150 mg/L COD
COD Vials TNT Plus Vial Test HACH TNT822 TNT 822, 20–1500 mg/L COD
Dessicator SP Bel-Art 942070050 Model: SP Scienceware
Dionized Water System Milli-Q ZIQ7010T0C IQ 7010 Pure & Ultrapure Water Purification System
Anhydrous CaSO4 W.A. Hammond Drierite Company 13001 8 Mesh, 1 lb
Glass Fiber Filters Whatman (Manufacturer) / Cole-Parmer (Vendor) 1827-150 Model: 934-AH
Heat Digestor Block HACH DRB200-02 DRB 200
Hot Plate Stirrer Corning 6795-620D Model: PC-620D
Industrial-Grade Nitrogen (Compressed Cylinder) Air Gas NI UHP300 300 cubic feet
Pellets (KOH) Fisher Scientific AC134062500 500 g
pH Meter Fisher Scientific 13-636-AP115 AP115, Accumet pH meter
UV Spectrophotometer HACH LPV400.99.00012 DR 3900
Vaccum Pump GAST 1HAB-25-M100X
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Krueger, B., Shetty, A., Esqueda, D., Bentley, L., Hooper, J., Zumbuhl, A., Butkus, M., Pfluger, A. Measuring Biomethane Potential of Food Scrap Waste Anaerobically Co-Digested with Waste-Activated Sludge Using Respirometry. J. Vis. Exp. (206), e66485, doi:10.3791/66485 (2024).
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