Este protocolo describe una buena práctica para determinar la producción de metano y los parámetros cinéticos microbianos mediante respirometría para la microbiota anaeróbica que codigiere los residuos de restos de alimentos y los lodos activados por residuos.
El uso de la respirometría para estudiar la biocinética de la microbiota en el tratamiento de aguas residuales o en la digestión de lodos de aguas residuales se ha vuelto más frecuente en las últimas décadas. El uso de la respirometría para examinar la biocinética de la microbiota anaeróbica que co-digiere flujos de residuos orgánicos, como aguas residuales, lodos y restos de comida, es un área de investigación activa. Hasta la fecha, no se ha publicado ningún protocolo visualizado sobre el tema. En consecuencia, en este protocolo, configuramos un respirómetro para medir la producción y el caudal de metano a lo largo del tiempo utilizando tres proporciones diferentes de alimentos a microorganismos (F:M) y residuos de restos de alimentos y lodos activados por residuos como sustratos. Los datos resultantes, junto con las mediciones de la utilización del sustrato, proporcionan la base para comprender cómo las diferentes concentraciones de sustrato influyen en la velocidad a la que la microbiota anaeróbica produce metano. Además, este protocolo presenta un método para desarrollar parámetros biocinéticos (por ejemplo, tasa de producción de metano, constante y rendimiento). Otros pueden utilizar este protocolo de respirometría para examinar la degradación orgánica en condiciones anaeróbicas y desarrollar parámetros microbianos.
Los investigadores estudian la actividad microbiana a escala de laboratorio utilizando una variedad de enfoques, incluidos estudios por lotes, microcosmos y respirometría, entre otros. Los respirómetros se pueden utilizar para medir la respiración celular a través de las fases de crecimiento y/o descomposición de una comunidad microbiana mediante la observación del consumo de sustrato y la producción del producto finalen condiciones controladas. Los resultados de los estudios con respirómetros a escala de banco también se pueden utilizar para estimar los parámetros biocinéticos para la construcción de modelos de proceso2. Los respirómetros se han utilizado para examinar la actividad microbiana aeróbica y anaeróbica; Sin embargo, los estudios que utilizan la respirometría para medir el potencial de biometano (BMP), especialmente de sustratos orgánicos mixtos, es un área de investigación en curso 3,4.
Los compuestos orgánicos de las aguas residuales domésticas son reconocidos como una fuente renovable viable de energía química5. La digestión anaeróbica de lodos de aguas residuales (es decir, lodos primarios y lodos activados por residuos, WAS) se ha utilizado para producir biogás rico en metano en plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) durante más de un siglo6. Sin embargo, la digestión de múltiples flujos de residuos orgánicos, como los residuos de restos de comida con WAS, se ha vuelto frecuente solo en los últimos años y sigue siendo un área activa de investigación. Los residuos de restos de alimentos son un flujo constante de residuos de material orgánico de alta densidad en muchos países desarrollados, que representa aproximadamente el 25% de la masa de los vertederos en los Estados Unidos7. Además de desviar una parte de los restos de comida de la eliminación en los vertederos, la combinación de restos de comida y WAS en un escenario de codigestión es ventajosa debido al mayor volumen de biogás producido (en relación con un solo flujo de residuos orgánicos). El biogás suele contener entre un 60 % y un 70 % de metano, entre un 30 % y un 40 % de dióxido de carbono y trazas de otros gases (por ejemplo, sulfuro de hidrógeno)8. El biogás puede limpiarse y quemarse in situ en las EDAR utilizando una tecnología combinada de calor y electricidad para compensar algunas de las necesidades de energía eléctrica y térmica9.
Varios estudios han examinado el potencial de biometanización y los parámetros biocinéticos de la microbiota anaeróbica que co-digiere residuos orgánicos1. Los estudios disponibles en la literatura han utilizado ensayos por lotes en frascos de suero donde la producción de metano se mide en puntos discretos a lo largo del experimento, mientras que otros han medido la producción de metano utilizando caudalímetros conectados directamente a biorreactores de banco o a escala piloto 2,10,11. La medición continua de la producción de metano utilizando un respirómetro, como el descrito en este protocolo, puede proporcionar mediciones continuas y precisas de metano a partir de un gran número de muestras realizadas en una variedad de condiciones experimentales 1,12. Si bien varios estudios han medido la producción de metano a partir de la co-digestión de WAS junto con otros sustratos orgánicos, como biorresiduos, grasas, aceites, grasas y desechos agrícolas 10,13,14, aún queda un trabajo significativo para identificar las tasas de producción de metano a partir de la gran variedad de escenarios de co-digestión. Además, hasta la fecha, no hay ningún protocolo disponible que proporcione un enfoque detallado, paso a paso, utilizando representaciones visuales para la medición de la producción de metano a partir de la codigestión de restos de alimentos y WAS. En consecuencia, este estudio presenta un protocolo de respirómetro para medir la producción de metano y derivar parámetros biocinéticos utilizando una mezcla de aguas residuales diluidas, WAS y residuos de restos de alimentos como sustratos. Se utilizaron diferentes proporciones de alimento a microorganismo (F:M) para ayudar a dilucidar los cambios en la producción de metano. Otras mediciones incluyen sólidos suspendidos volátiles (VSS), demanda química de oxígeno (DQO) y pH de cada muestra. Este protocolo describe la configuración del respirómetro, la creación de muestras y las mediciones críticas.
Los métodos proporcionados en este protocolo pueden ayudar a los investigadores y profesionales a determinar el potencial biometano de la digestión anaeróbica de flujos de residuos orgánicos mediante respirometría. En este protocolo, demostramos la generación de metano a partir de la codigestión de un flujo típico de residuos de restos de comida junto con WAS de una EDAR en un rango de proporciones F:M. Este protocolo se suma a la literatura al proporcionar un enfoque de respirometría paso a paso para la medición continua de la producción de metano y la determinación de parámetros biocinéticos mediante modelos cinéticos de primer orden. Varios otros estudios han empleado experimentos de microcosmos que miden la producción de metano en puntos discretos en el tiempo10,22, mientras que otros han medido el metano utilizando caudalímetros conectados a biorreactores de banco de flujo continuo de larga duración o a escala piloto14,23. La respirometría ofrece la ventaja de medir la producción de metano de forma continua en una variedad de condiciones experimentales. Como los experimentos de respirometría no requieren la construcción de un biorreactor, las condiciones experimentales pueden modificarse con frecuencia relativa en comparación con algunos experimentos a escala de laboratorio o piloto. Debido a esta ventaja, los experimentos de respirometría se pueden utilizar para determinar la producción de metano a partir de la co-digestión de numerosas combinaciones de desechos orgánicos en un período de tiempo relativamente corto. Por ejemplo, como siguiente paso al protocolo presentado en este estudio, las grasas, aceites y grasas, que son muy densos en energía química en relación con el WAS, podrían ser co-digeridos con restos de comida para cuantificar los probables aumentos en la generación de metano a lo largo del tiempo. La aplicación de este enfoque puede continuar construyendo el cuerpo de literatura sobre las tasas de generación de metano y los parámetros biocinéticos en múltiples combinaciones de sustratos en esquemas de co-digestión. Además, además de determinar las combinaciones óptimas de sustratos, los resultados de producción de metano y los parámetros biocinéticos se pueden utilizar para informar el modelado del rendimiento en los programas existentes, como los diseñados para el tratamiento de aguas residuales, o para predecir cómo se comportarán los esquemas de codigestión cuando se amplíen desde la escala de laboratorio o piloto hasta la escala completa24,25.
Además, este protocolo podría modificarse para aplicar una alimentación de sustrato a medida para el consorcio microbiano anaeróbico. Por ejemplo, si un investigador quisiera examinar los efectos de proporcionar solo carbohidratos o solo proteínas a la microbiota anaeróbica, entonces la materia prima de este protocolo podría modificarse en consecuencia. Alternativamente, si un investigador quisiera probar el impacto de agregar una fracción específica de DQO (por ejemplo, solo DQO soluble o solo DQO particulado) o altas concentraciones de un sustrato particular (por ejemplo, acetato, ácido graso volátil y producto intermedio del metabolismo anaeróbico) en la producción de metano, se podría utilizar una variación de este protocolo. Una de las mejores prácticas observadas al modificar el sustrato o alternar la relación F:M de un sustrato en particular es mantener la misma masa de microbiota anaeróbica para cada muestra, ajustando solo la masa del sustrato (se deben emplear relaciones masa-masa). Además de modificar los sustratos, los investigadores pueden utilizar este protocolo con otros análisis para obtener una mejor comprensión del uso del sustrato y la producción de metano. Por ejemplo, un investigador podría utilizar este protocolo junto con análisis de comunidades microbianas (por ejemplo, secuenciación del gen 16S rRNA o metagenómica) para relacionar mejor la estructura de la comunidad con la función.
A pesar de la utilidad de esta metodología, existen varias limitaciones. Los respirómetros y las pruebas de potencial de biometano se configuran con mayor frecuencia como reactores discontinuos; Sin embargo, los codigestores anaeróbicos a gran escala normalmente funcionan como sistemas de flujo continuo con tiempos de retención de lodos de más de 10 días1. En consecuencia, los datos obtenidos de los experimentos de respirometría son útiles para estimar las tasas de generación de metano y desarrollar parámetros biocinéticos, pero estos datos deben validarse en el campo utilizando digestores a mayor escala operados a lo largo del tiempo cuando sea posible.
Además, se debe tener cuidado al seleccionar y preparar las muestras antes de la respirometría. Las partículas grandes de restos de comida sesgarán las mediciones de VSS y DQO y pueden proporcionar resultados inexactos. Si se utilizan residuos de restos de comida como sustrato, la mezcla debe estar bien macerada y libre de partículas grandes de alimentos, un enfoque similar a la maceración en los pozos de recepción de restos de comida en los digestores a gran escala. La dilución con agua desionizada puede ayudar con el proceso de mezcla y es similar a la adición de agua que se usa comúnmente cuando los restos de comida se maceran a mayor escala. Sin embargo, se debe hacer todo lo posible para garantizar que las diluciones se midan correctamente y que se alcance el contenido de humedad objetivo. La dilución puede ser fácilmente una fuente de error, especialmente si los estudiantes sin experiencia están ejecutando este protocolo.
Dado que los consorcios microbianos existentes en la co-digestión contienen anaerobios obligados, se debe tener especial cuidado en eliminar (o reducir en gran medida) la exposición al oxígeno durante los procesos de transferencia y preparación de la muestra. El oxígeno se puede eliminar de los frascos de muestra mediante lavado con nitrógeno. Además, si está disponible, el trabajo de transferencia de cultivo anaeróbico entre los frascos de recolección y los frascos de muestra del respirómetro debe realizarse en una cámara anaeróbica. Dado que el respirómetro proporciona resultados consistentes (volúmenes y tasas de producción de metano), cualquier desviación de los resultados esperados, por ejemplo, un consorcio microbiano inviable, se puede identificar fácilmente hacia el comienzo de la prueba. El uso de una muestra duplicada o triplicada puede ayudar aún más a identificar pruebas defectuosas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Jim Young de Respirometer Systems and Applications por la discusión sobre el desarrollo de este protocolo.
103 °C Oven Isotemp | Fisher Scientific | 13-247-737F | Model: 737F, Force Air Oven |
550 °C Vulcan Oven | Neytech (Manufacturer) / Cole Palmer (Vendor) | 9493308 | Model: 3-550 |
Aerobic/Anaerobic Respirometer | Respirometer System and Applications (RSA) | PF-8000 | Model: PF-8000 |
Analytical Balance | Mettler Toledo | 30029075 | Model: ME204E, Detection Limit: 0.1 mg |
Smoothie Blender with 56 oz Plastic Jar | Hamilton Beach | 50190F | Model: 50190F |
COD Vials TNT Plus Vial Test | HACH | TNT821 | TNT 821, 3–150 mg/L COD |
COD Vials TNT Plus Vial Test | HACH | TNT822 | TNT 822, 20–1500 mg/L COD |
Dessicator | SP Bel-Art | 942070050 | Model: SP Scienceware |
Dionized Water System | Milli-Q | ZIQ7010T0C | IQ 7010 Pure & Ultrapure Water Purification System |
Anhydrous CaSO4 | W.A. Hammond Drierite Company | 13001 | 8 Mesh, 1 lb |
Glass Fiber Filters | Whatman (Manufacturer) / Cole-Parmer (Vendor) | 1827-150 | Model: 934-AH |
Heat Digestor Block | HACH | DRB200-02 | DRB 200 |
Hot Plate Stirrer | Corning | 6795-620D | Model: PC-620D |
Industrial-Grade Nitrogen (Compressed Cylinder) | Air Gas | NI UHP300 | 300 cubic feet |
Pellets (KOH) | Fisher Scientific | AC134062500 | 500 g |
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AP115 | AP115, Accumet pH meter |
UV Spectrophotometer | HACH | LPV400.99.00012 | DR 3900 |
Vaccum Pump | GAST | 1HAB-25-M100X |