Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella
Summary
El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .
Abstract
Shigella, patógeno bacteriano entérico adaptado al ser humano, causa millones de infecciones cada año, crea efectos de crecimiento a largo plazo entre los pacientes pediátricos y es una de las principales causas de muertes diarreicas en todo el mundo. La infección induce diarrea acuosa o sanguinolenta como resultado de que el patógeno transita por el tracto gastrointestinal e infecta las células epiteliales que recubren el colon. Con el asombroso aumento de la resistencia a los antibióticos y la actual falta de vacunas aprobadas, los protocolos de investigación estandarizados son fundamentales para estudiar este formidable patógeno. Aquí, se presentan metodologías para examinar la patogénesis molecular de Shigella utilizando análisis in vitro de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular en células epiteliales del colon. Antes de los análisis de infección, el fenotipo de virulencia de las colonias de Shigella se verificó mediante la absorción del colorante rojo Congo en placas de agar. También se pueden considerar medios de laboratorio suplementados durante el cultivo bacteriano para imitar las condiciones in vivo. A continuación, las células bacterianas se utilizan en un protocolo estandarizado para infectar las células epiteliales del colon en placas de cultivo de tejidos en una multiplicidad establecida de infección con adaptaciones para analizar cada etapa de la infección. Para los ensayos de adherencia, las células de Shigella se incuban con niveles reducidos de medios para promover el contacto bacteriano con las células epiteliales. Tanto para los ensayos de invasión como para los de replicación intracelular, la gentamicina se aplica durante varios intervalos de tiempo para eliminar las bacterias extracelulares y permitir la evaluación de la invasión y/o la cuantificación de las tasas de replicación intracelular. Todos los protocolos de infección enumeran las bacterias adherentes, invadidas y/o intracelulares mediante la dilución en serie de lisados de células epiteliales infectadas y la siembra de unidades formadoras de colonias bacterianas en relación con los títulos de infección en placas de agar rojo Congo. En conjunto, estos protocolos permiten la caracterización independiente y las comparaciones para cada etapa de la infección por Shigella de las células epiteliales para estudiar este patógeno con éxito.
Introduction
Las enfermedades diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos son una importante carga para la salud mundial. En 2016, las enfermedades diarreicas fueron responsables de 1,3 millones de muertes en todo el mundo y fueron la cuarta causa de muerte en niños menores de cinco años 1,2. El patógeno bacteriano entérico gramnegativo Shigella es el agente causal de la shigelosis, una de las principales causas de muerte diarreica en todo el mundo3. La shigelosis causa una morbilidad y mortalidad significativas cada año en niños de países de ingresos bajos y medianos 4,5, mientras que las infecciones en los países de ingresos altos están relacionadas con brotes de guarderías, transmitidos por los alimentos y por el agua 6,7,8,9. El desarrollo ineficaz de vacunas10 y el aumento de las tasas de resistencia a los antimicrobianos (RAM)11,12 han complicado el tratamiento de los brotes de Shigella a gran escala. Datos recientes de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades muestran que casi el 46% de las infecciones por Shigella en los Estados Unidos mostraron resistencia a los medicamentos en 202013,14, mientras que la Organización Mundial de la Salud ha declarado a Shigella como un patógeno prioritario de la resistencia a los antimicrobianos para el que se necesitan urgentemente nuevas terapias15.
Las infecciones por Shigella se transmiten fácilmente por vía fecal-oral tras la ingestión de alimentos o agua contaminados, o por contacto humano directo. Shigella ha evolucionado hasta convertirse en un patógeno eficiente y adaptado al ser humano, con una dosis infecciosa de 10-100 bacterias suficiente para causar la enfermedad16. Durante el tránsito del intestino delgado, Shigella está expuesta a señales ambientales, como temperatura elevada y bilis17. La detección de estas señales induce cambios transcripcionales para expresar factores de virulencia que potencian la capacidad de la bacteria para infectar el colon humano 17,18,19. Shigella no invade el epitelio colónico desde la superficie apical, sino que transita a través de la capa epitelial después de ser absorbida por células especializadas de micropliegues presentadores de antígenos (células M) dentro del epitelio asociado al folículo 20,21,22. Después de la transcitosis, las células de Shigella son fagocitadas por los macrófagos residentes. Shigella escapa rápidamente del fagosoma y desencadena la muerte celular de los macrófagos, lo que resulta en la liberación de citoquinas proinflamatorias 5,23,24. A continuación, Shigella invade las células epiteliales del colon desde el lado basolateral, lisa la vacuola macropinocítica y establece un nicho replicativo en el citoplasma 5,25. Las citocinas proinflamatorias, en particular la interleucina-8 (IL-8), reclutan leucocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) en el sitio de la infección, lo que debilita las uniones estrechas epiteliales y permite la infiltración bacteriana del revestimiento epitelial para exacerbar la infección basolateral5. Las PMN destruyen el revestimiento epitelial infectado para contener la infección, lo que da lugar a los síntomas característicos de la disentería bacilar (sanguinolenta)5. Aunque los mecanismos de invasión y replicación intracelular han sido ampliamente caracterizados, nuevas investigaciones están demostrando nuevos conceptos importantes en la infección por Shigella, incluyendo la regulación de la virulencia durante el tránsito gastrointestinal (GI)17, la adherencia19, la mejora del acceso basolateral a través de la permeabilidad de barrera26 y el porte asintomático en niños desnutridos27.
La capacidad de Shigella spp. para causar enfermedades diarreicas está restringida a humanos y primates no humanos (NHP)28. Se han desarrollado modelos de infección intestinal por Shigella para pez cebra29, ratones30, cobayas31, conejos 21,32,33 y cerdos34,35. Sin embargo, ninguno de estos sistemas modelo puede replicar con precisión las características de la enfermedad observadas durante la infección humana36. Aunque se han establecido modelos NHP de shigelosis para estudiar la patogénesis de Shigella, estos sistemas modelo son costosos de implementar y requieren dosis infecciosas artificialmente altas, hasta nueve órdenes de magnitud más altas que la dosis infecciosa de los humanos 37,38,39,40,41,42. Por lo tanto, la notable adaptación de Shigella para la infección de huéspedes humanos requiere el uso de cultivos celulares derivados de humanos para recrear modelos fisiológicamente relevantes para un interrogatorio preciso de la patogénesis de Shigella.
Aquí, se describen procedimientos detallados para medir las tasas de adherencia de Shigella , invasión y replicación dentro de las células epiteliales del colon HT-29. Utilizando estos protocolos estandarizados, se pueden interrogar los mecanismos moleculares por los cuales los genes de virulencia bacteriana y las señales ambientales afectan cada paso de la infección por Shigella para comprender mejor la relación dinámica de interacción huésped-patógeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un conjunto de tres ensayos estandarizados para estudiar la adherencia a Shigella, la invasión y la replicación intracelular de las células epiteliales intestinales. Aunque estos métodos no son más que versiones modificadas de los ensayos clásicos de gentamicina utilizados para estudiar la invasión y replicación intracelular de diversos patógenos bacterianos dentro de las células huésped 49,50,51, se deben aplicar consideraciones especiales cuando se estudia Shigella.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo a los autores incluye el Departamento de Pediatría del Hospital General de Massachusetts, el premio 2022A009041 del Comité Ejecutivo de Financiación de Apoyo Provisional a la Investigación (ISF), la subvención del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas R21AI146405 y la subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales del Centro de Investigación de la Obesidad y la Nutrición de Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 0.22 μm PES filter | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media |
| 14 mL culture tubes | Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap |
| 6-well tissue culture plates | Corning | 3516 | Plates are treated for optimal cell attachment |
| Bile salts | Sigma-Aldrich | B8756 | 1:1 ratio of cholate to deoxycholate |
| Congo red dye | Sigma-Aldrich | C6277 | A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity |
| Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | To be used with the Countess Automated Cell Counter |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | A a highly polar organic reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat-inactivated, sterile |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G3632 | Stock concentration is 50 mg/mL |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin |
| Paraffin film | Bemis | PM999 | Laboratory sealing film |
| Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x concentration; pH 7.4 |
| Select agar | Invitrogen | 30391023 | A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media |
| T75 flasks | Corning | 430641U | Tissue culture flasks |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | A common non-ionic surfactant and emulsifier |
| Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Bacterial growth media |
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