Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Durchfallerkrankungen, die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, sind eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung. Im Jahr 2016 waren Durchfallerkrankungen weltweit für 1,3 Millionen Todesfälle verantwortlich und waren die vierthäufigste Todesursache bei Kindern unter fünf Jahren ^1,2. Der gramnegative, enterische bakterielle Erreger Shigella ist der Erreger der Shigellose, einer der Hauptursachen für Durchfalltodesfälle weltweit³. Shigellose verursacht jedes Jahr eine signifikante Morbidität und Mortalität bei Kindern aus Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen ^4,5, während Infektionen in Ländern mit hohem Einkommen mit Ausbrüchen in Kindertagesstätten, lebensmittelbedingten und wasserbedingten Ausbrüchen zusammenhängen ^6,7,8,9. Die ineffektive Entwicklung von Impfstoffen 10 und die steigenden Raten von Antibiotikaresistenzen (AMR)^11,12 haben das Management von großflächigen Shigella-Ausbrüchen erschwert. Jüngste Daten der Centers for Disease Control and Prevention zeigen, dass fast 46 % der Shigella-Infektionen in den Vereinigten Staaten im Jahr 2020 eine Arzneimittelresistenz aufwiesen^13,14, während die Weltgesundheitsorganisation Shigella zu einem vorrangigen AMR-Erreger erklärt hat, für den dringend neue Therapien benötigt werden¹⁵.

Shigella-Infektionen werden leicht über den fäkal-oralen Weg übertragen, wenn kontaminierte Lebensmittel oder Wasser aufgenommen werden, oder durch direkten menschlichen Kontakt. Shigella hat sich zu einem effizienten, an den Menschen angepassten Krankheitserreger entwickelt, mit einer infektiösen Dosis von 10-100 Bakterien, die ausreicht, um Krankheiten zu verursachen¹⁶. Während der Dünndarmpassage ist Shigella Umweltsignalen wie erhöhter Temperatur und Galle^{ausgesetzt 17}. Der Nachweis dieser Signale induziert transkriptionelle Veränderungen, um Virulenzfaktoren zu exprimieren, die die Fähigkeit der Bakterien verbessern, den menschlichen Dickdarm zu infizieren 17,18,19. Shigella dringt nicht von der apikalen Oberfläche in das Dickdarmepithel ein, sondern durchquert die Epithelschicht und folgt der Aufnahme in spezialisierte antigenpräsentierende Mikrofaltenzellen (M-Zellen) innerhalb des follikelassoziierten Epithels 20,21,22. Nach der Transzytose werden Shigella-Zellen von residenten Makrophagen phagozytiert. Shigella entkommt schnell dem Phagosom und löst den Zelltod der Makrophagen aus, was zur Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen führt ^5,23,24. Shigella dringt dann von der basolateralen Seite in Dickdarmepithelzellen ein, lysiert die makropinozytäre Vakuole und etabliert eine replikative Nische im Zytoplasma ^5,25. Proinflammatorische Zytokine, insbesondere Interleukin-8 (IL-8), rekrutieren polymorphkernige neutrophile Leukozyten (PMNs) an den Ort der Infektion, was die epithelialen Tight Junctions schwächt und eine bakterielle Infiltration der Epithelaushaut ermöglicht, um die basolaterale Infektion zu verschlimmern⁵. Die PMNs zerstören die infizierte Epithelschleimhaut, um die Infektion einzudämmen, was zu den charakteristischen Symptomen einer bazillären (blutigen) Ruhr führt⁵. Obwohl die Invasions- und intrazellulären Replikationsmechanismen gründlich charakterisiert wurden, zeigen neue Forschungsergebnisse wichtige neue Konzepte bei Shigella-Infektionen, einschließlich der Virulenzregulation während des gastrointestinalen (GI) Transits¹⁷, der Adhärenz¹⁹, des verbesserten basolateralen Zugangs durch Barrierepermeabilität²⁶ und der asymptomatischen Übertragung bei unterernährten Kindern²⁷.

Die Fähigkeit von Shigella spp., Durchfallerkrankungen zu verursachen, ist auf Menschen und nicht-menschliche Primaten (NHP) ^{beschränkt28}. Shigella-Darminfektionsmodelle wurden für Zebrafische²⁹, Mäuse³⁰, Meerschweinchen³¹, Kaninchen^{21, 32, 33} und Schweine^{34, 35} entwickelt. Keines dieser Modellsysteme kann jedoch die während einer menschlichen Infektion beobachteten Krankheitsmerkmale genau reproduzieren³⁶. Obwohl NHP-Modelle der Shigellose zur Untersuchung der Shigella-Pathogenese etabliert wurden, sind diese Modellsysteme teuer in der Implementierung und erfordern künstlich hohe infektiöse Dosen, die bis zu neun Größenordnungen höher sind als die infektiöse Dosis des Menschen 37,38,39,40,41,42. Daher erfordert die bemerkenswerte Anpassung von Shigella an die Infektion menschlicher Wirte die Verwendung von Zellkulturen menschlichen Ursprungs, um physiologisch relevante Modelle für eine genaue Untersuchung der Shigella-Pathogenese zu erstellen.

Hier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um die Raten der Shigella-Adhärenz, Invasion und Replikation innerhalb von HT-29-Dickdarmepithelzellen zu messen. Mit diesen standardisierten Protokollen können die molekularen Mechanismen, durch die bakterielle Virulenzgene und Umweltsignale jeden Schritt der Shigella-Infektion beeinflussen, untersucht werden, um die dynamische Wirt-Pathogen-Interaktionsbeziehung besser zu verstehen.