JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella

Published: February 09, 2024
doi:
10.3791/66426
, ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Het huidige protocol beschrijft infectietests om de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatie van Shigella te ondervragen met behulp van in vitro epitheelcellijnen.

Abstract

De aan de mens aangepaste darmbacteriële ziekteverwekker Shigella veroorzaakt miljoenen infecties per jaar, creëert langdurige groei-effecten bij pediatrische patiënten en is wereldwijd een belangrijke oorzaak van sterfgevallen door diarree. Infectie veroorzaakt waterige of bloederige diarree als gevolg van de ziekteverwekker die het maagdarmkanaal passeert en de epitheelcellen langs de dikke darm infecteert. Met een duizelingwekkende toename van antibioticaresistentie en het huidige gebrek aan goedgekeurde vaccins, zijn gestandaardiseerde onderzoeksprotocollen van cruciaal belang voor het bestuderen van deze formidabele ziekteverwekker. Hier worden methodologieën gepresenteerd om de moleculaire pathogenese van Shigella te onderzoeken met behulp van in vitro analyses van bacteriële adherentie, invasie en intracellulaire replicatie in epitheelcellen van de dikke darm. Voorafgaand aan infectieanalyses werd het virulentiefenotype van Shigella-kolonies geverifieerd door de opname van de Congorode kleurstof op agarplaten. Aangevuld laboratoriummedium kan ook worden overwogen tijdens het kweken van bacteriën om in vivo omstandigheden na te bootsen. Bacteriële cellen worden vervolgens gebruikt in een gestandaardiseerd protocol om darmepitheelcellen in weefselkweekplaten te infecteren bij een vastgestelde multipliciteit van infectie met aanpassingen om elk stadium van infectie te analyseren. Voor hechtingstesten worden Shigella-cellen geïncubeerd met verlaagde medianiveaus om bacterieel contact met epitheelcellen te bevorderen. Voor zowel invasie- als intracellulaire replicatietests wordt gentamicine gedurende verschillende tijdsintervallen toegepast om extracellulaire bacteriën te elimineren en de beoordeling van invasie en/of de kwantificering van intracellulaire replicatiesnelheden mogelijk te maken. Alle infectieprotocollen sommen aanhangende, binnengedrongen en/of intracellulaire bacteriën op door geïnfecteerde epitheelcellysaten serieel te verdunnen en bacteriële kolonievormende eenheden te plateren ten opzichte van infecterende titers op Congo-rode agarplaten. Samen maken deze protocollen onafhankelijke karakterisering en vergelijkingen mogelijk voor elk stadium van Shigella-infectie van epitheelcellen om deze ziekteverwekker met succes te bestuderen.

Introduction

Diarreeziekten veroorzaakt door darmbacteriële pathogenen vormen een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast. In 2016 waren diarreeziekten verantwoordelijk voor 1,3 miljoen sterfgevallen wereldwijd en waren ze de vierde belangrijkste doodsoorzaak bij kinderen jonger dan vijf jaar 1,2 jaar. De Gram-negatieve, enterische bacteriële ziekteverwekker Shigella is de veroorzaker van shigellose, een belangrijke oorzaak van sterfgevallen door diarreewereldwijd3. Shigellose veroorzaakt elk jaar aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij kinderen uit lage- en middeninkomenslanden 4,5, terwijl infecties in landen met een hoog inkomen verband houden met uitbraken van kinderdagverblijven, door voedsel overgedragen en door water overgedragen uitbraken 6,7,8,9. Ineffectieve vaccinontwikkeling10 en stijgende percentages antimicrobiële resistentie (AMR)11,12 hebben het beheer van grootschalige Shigella-uitbraken bemoeilijkt. Uit recente gegevens van de Centers for Disease Control and Prevention blijkt dat bijna 46% van de Shigella-infecties in de Verenigde Staten in 2020 resistentie tegen geneesmiddelen vertoonde13,14, terwijl de Wereldgezondheidsorganisatie Shigella heeft uitgeroepen tot een prioritaire AMR-ziekteverwekker waarvoor dringend nieuwe therapieën nodig zijn15.

Shigella-infecties worden gemakkelijk overgedragen via de fecaal-orale route bij inname van besmet voedsel of water, of door direct menselijk contact. Shigella is geëvolueerd tot een efficiënte, aan de mens aangepaste ziekteverwekker, met een infectieuze dosis van 10-100 bacteriën die voldoende zijn om ziekte te veroorzaken16. Tijdens de overgang van de dunne darm wordt Shigella blootgesteld aan omgevingssignalen, zoals verhoogde temperatuur en gal17. Detectie van deze signalen induceert transcriptionele veranderingen om virulentiefactoren tot expressie te brengen die het vermogen van de bacteriën om de menselijke dikke darm te infecteren verbeteren 17,18,19. Shigella dringt het epitheel van de dikke darm niet binnen vanaf het apicale oppervlak, maar passeert eerder door de epitheellaag na opname in gespecialiseerde antigeenpresenterende microvouwcellen (M-cellen) in het follikel-geassocieerde epitheel 20,21,22. Na transcytose worden Shigella-cellen gefagocyteerd door residente macrofagen. Shigella ontsnapt snel aan het fagosoom en veroorzaakt de celdood van macrofagen, wat resulteert in het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines 5,23,24. Shigella dringt vervolgens de epitheelcellen van de dikke darm binnen vanaf de basolaterale zijde, lyseert de macropinocytaire vacuole en vestigt een replicatieve niche in het cytoplasma 5,25. Pro-inflammatoire cytokines, met name interleukine-8 (IL-8), rekruteren polymorfonucleaire neutrofiele leukocyten (PMN’s) naar de plaats van infectie, wat de epitheliale tight junctions verzwakt en bacteriële infiltratie van de epitheelbekleding mogelijk maakt om de basolateraleinfectie te verergeren. De PMN’s vernietigen het geïnfecteerde epitheelslijmvlies om de infectie in te dammen, wat resulteert in de karakteristieke symptomen van bacillaire (bloederige)dysenterie. Hoewel invasie- en intracellulaire replicatiemechanismen grondig zijn gekarakteriseerd, toont nieuw onderzoek belangrijke nieuwe concepten aan bij Shigella-infectie, waaronder virulentieregulatie tijdens gastro-intestinale (GI) transit17, therapietrouw19, verbeterde basolaterale toegang door barrièrepermeabiliteit26 en asymptomatisch dragerschap bij ondervoede kinderen27.

Het vermogen van Shigella spp. om diarree te veroorzaken is beperkt tot mensen en niet-menselijke primaten (NHP)28. Shigella darminfectiemodellen zijn ontwikkeld voor zebravissen29, muizen30, cavia’s31, konijnen 21,32,33 en varkens34,35. Geen van deze modelsystemen kan echter nauwkeurig de ziektekenmerken repliceren die worden waargenomen tijdens menselijke infectie36. Hoewel NHP-modellen van shigellose zijn opgesteld om de pathogenese van Shigella te bestuderen, zijn deze modelsystemen duur om te implementeren en vereisen ze kunstmatig hoge infectieuze doses, tot negen ordes van grootte hoger dan de infectieuze dosis van mensen 37,38,39,40,41,42. De opmerkelijke aanpassing van Shigella voor infectie van menselijke gastheren vereist dus het gebruik van van mensen afgeleide celculturen om fysiologisch relevante modellen na te bootsen voor nauwkeurige ondervraging van de pathogenese van Shigella.

Hier worden gedetailleerde procedures beschreven om de mate van Shigella-therapietrouw , invasie van en replicatie in HT-29 colonepitheelcellen te meten. Met behulp van deze gestandaardiseerde protocollen kunnen de moleculaire mechanismen waarmee bacteriële virulentiegenen en omgevingssignalen elke stap van Shigella-infectie beïnvloeden, worden ondervraagd om de dynamische interactierelatie tussen gastheer en ziekteverwekker beter te begrijpen.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en materialen OPMERKING: Alle volumes komen overeen met een test met behulp van twee platen met 6 putjes. TSB medium: Voeg 0,5 L gedeïoniseerd (DI) water toe aan 15 g Tryptic Soy Broth (TSB, zie Tabel met Materialen) medium en autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur. Galzouten medium (TSB + BS): Om TSB te bereiden die 0,4% (m/v) galzouten bevat, resuspendeert u 0,06 g galzouten (BS, zie materiaaltabel</st…

Representative Results

Therapietrouw-, invasie- en intracellulaire replicatietests werden uitgevoerd waarbij S. flexneri 2457T wildtype (WT) werd vergeleken met S. flexneri ΔVF (ΔVF), een mutant waarvan wordt verondersteld dat deze de virulentie van Shigella negatief reguleert. Aangezien Shigella galzouten gebruikt als signaal om virulentie te reguleren 17,18,47, werden experimenten uitgevoerd na bacteriële subcultuur in TSB-media en TSB aangevuld met 0,4% (w/v) galzouten …

Discussion

Dit protocol beschrijft een reeks van drie gestandaardiseerde assays om Shigella-adhesie, invasie en intracellulaire replicatie van darmepitheelcellen te bestuderen. Hoewel deze methoden slechts aangepaste versies zijn van klassieke gentamicine-assays die worden gebruikt om de invasie en intracellulaire replicatie van verschillende bacteriële pathogenen in gastheercellen te bestuderen 49,50,51, moeten speciale overwegingen worden toegepast bij het bestuderen van<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ondersteuning voor de auteurs omvat de afdeling Kindergeneeskunde van het Massachusetts General Hospital, de Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF)-prijs 2022A009041, de subsidie van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases R21AI146405 en de National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases-subsidie Nutrition Obesity Research Center in Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Materials

0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin – United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023)
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer’s patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -. M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -. H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -. I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -. J., Yeo, S. -. G., Park, J. -. H., Ko, H. -. J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 (2023)
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol – Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

ShigellaEpithelial CellInfectionGastrointestinal TractDiarrheaDysenteryAnimal ModelsVirulence GenesBile SaltsGlucoseAdherenceInvasionIntracellular SurvivalEpithelial Cell LineHuman GI ModelsAntibiotic ResistanceVaccinesMolecular PathogenesisAdherenceInvasionIntracellular ReplicationColonic Epithelial CellsVirulence Phenotype

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image