Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

1. Preparación de reactivos y materiales NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos. Medio TSB: Añadir 0,5 L de agua desionizada (DI) a 15 g de medio caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabla de Materiales) y autoclave. Almacenar a temperatura ambiente. Medio de sales biliares (TSB + BS): Para preparar TSB que contenga 0,4% (p/v) de sales biliares, vuelva a suspender 0,06 g de sales biliares (BS, consulte la Tabla de materiales) en 15 ml de TSB esterilizada en autoclave. Esterilizar con filtro con un filtro PES de 0,22 μm.NOTA: Las sales biliares consisten en una mezcla 1:1 de colato de sodio y desoxicolato de sodio. Prepare los medios nuevos inmediatamente antes de usarlos. DMEM + 10% (v/v) FBS: Agregue 5 mL de suero fetal bovino (FBS) a 45 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco. Conservar a 4 °C. DMEM + gentamicina: A un tubo de 50 ml, agregue 50 ml de DMEM y 50 μl de gentamicina de 50 mg/ml (ver Tabla de materiales).NOTA: Preparar alícuotas frescas y calentar en un baño de agua a 37 °C antes de cada experimento. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Agregue 150 μL de Triton X-100 a 15 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).NOTA: Preparar alícuotas frescas y calentar en un baño de agua a 37 °C antes de cada experimento. Placas indicadoras TSB + Congo rojo: Agregue 15 g de TSB, 7,5 g de agar seleccionado y 0,125 g de colorante rojo Congo (ver Tabla de materiales) a una botella de 1 L. Agregue 0,5 L de agua desionizada y autoclave. Vierta 10-20 ml de medio en placas de Petri estériles individuales (100 mm x 15 mm) y deje que se solidifique.PRECAUCIÓN: El rojo del Congo es cancerígeno y una toxina reproductiva. Asegúrese de que la manipulación del rojo Congo se realice utilizando el equipo de protección personal adecuado. Consulte la hoja de datos de seguridad del producto para obtener información adicional.NOTA: Aproximadamente 20 placas están hechas de medios rojos Congo de 0,5 L. Los platos se pueden preparar con 2-3 días de anticipación y dejar invertidos a temperatura ambiente hasta su uso. Para el almacenamiento a largo plazo, coloque las placas invertidas en fundas de plástico a 4 °C durante un máximo de 3 meses. DMEM + 10 % (v/v) de FBS y 5 % (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO): Agregue 42,5 ml de DMEM, 5 ml de FBS y 2,5 ml de DMSO a un tubo de 50 ml. Conservar a 4 °C. 2. Preparación de bacterias NOTA: Todos los protocolos de cultivo y almacenamiento de Shigella en laboratorio están adaptados de Payne, S. M.43. PRECAUCIÓN: Shigella spp. son patógenos del Grupo de Riesgo2 44. Realice todo el trabajo de laboratorio en un entorno BSL-2, con medidas de seguridad adicionales para limitar las exposiciones accidentales debido a la baja dosis infecciosa de Shigella spp. Crecimiento de Shigella a partir de existencias congeladasTransfiera una pequeña cantidad de cultivo congelado del vial criogénico a una placa de agar rojo TSB + Congo con un aplicador estéril. Esterilizar con llama un asa de inoculación y dejar que se enfríe. Raye el inóculo hacia adelante y hacia atrás a través de un cuadrante de la placa. Enciende el bucle, deja que se enfríe y luego pasa del primer cuadrante al segundo cuadrante del plato. Repita para rayar el inóculo en el tercer y cuarto cuadrante de la placa.NOTA: Alternativamente, aplique el inóculo de rayas con un aplicador estéril nuevo entre cada cuadrante. Invierta la placa e incube a 37 °C durante la noche.NOTA: Se requiere incubación a temperaturas de ≥37 °C para la expresión de los factores de virulencia de Shigella necesarios para la observación del fenotipo45 rojo Congo positivo (CR+). Las colonias avirulentas tendrán un aspecto blanco y no serán invasivas. Sellar la placa con film de parafina y conservar refrigerada a 4 °C.NOTA: Las colonias bacterianas permanecerán viables en placas de agar durante 1-2 semanas. Crecimiento nocturno de Shigella en cultivo líquidoAlícuota 3 mL de medio TSB en tubos de cultivo estériles de 14 mL. Elija una sola colonia roja (CR+) bien aislada con un aplicador estéril y vuelva a suspenderla en medios líquidos. Incubar los cultivos durante la noche (16-18 h) a 37 °C con agitación a 250 rotaciones por minuto (rpm). 3. Preparación de células eucariotas HT-29 NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos. Las líneas celulares HT-29 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Los protocolos de mantenimiento HT-29 son una adaptación de las recomendaciones46 de la ATCC. Todos los medios deben precalentarse en un baño de agua a 37 °C antes de su uso. Todos los protocolos de mantenimiento de HT-29 deben realizarse en un gabinete de bioseguridad. Absténgase de producir burbujas al mezclar/trabajar con células HT-29 en medios para evitar cambios drásticos en el pH. Descongelación de células HT-29 de material congeladoDescongelar el vial de células HT-29 en un baño de agua a 37 °C.NOTA: Asegúrese de que la tapa permanezca completamente por encima del agua para evitar la contaminación. La descongelación debe tomar menos de 2 minutos. Retire el vial del agua inmediatamente después de que el cultivo esté completamente descongelado y descontamine con etanol al 70%. Asegúrese de que todos los pasos a partir de este punto se realicen utilizando técnicas asépticas. Añadir todo el contenido del vial a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 9 mL de DMEM + 10% de FBS. Centrifugar a 125 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante en un contenedor de residuos y resuspender el pellet en 10 mL de DMEM tibio + 10% FBS. Transferir las células resuspendidas a un matraz de cultivo de tejidos de 75cm2 (T75) que contenga 10 mL de DMEM caliente + 10% de FBS (volumen total de 20 mL). Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 90% de confluencia (aproximadamente 6-7 días).NOTA: La confluencia se estima a través de una aproximación visual. Siembra de células HT-29Precalentar 20 mL de PBS y 50 mL de DMEM + 10% FBS en un baño de agua a 37 °C y precalentar 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) a temperatura ambiente. Una vez que las células HT-29 (del paso 3.1) alcancen el 90% de confluencia, decantar los medios de cultivo celular HT-29 del matraz T75 en un contenedor de residuos. Vierta ~ 10 ml de PBS tibio en el matraz y revuelva suavemente para lavar. Decantar el PBS en un contenedor de residuos. Lavar con PBS tibio de nuevo y decantar. Añadir 2-3 ml de tripsina-EDTA al 0,25% (p/v) y agitar suavemente por toda la superficie. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 min. Retire el matraz de la incubadora y agite suavemente la tripsina-EDTA, asegurándose visualmente de que todas las células se desprendan de la superficie. Agregue inmediatamente 6 ml de DMEM tibio + 10% de FBS para desactivar la tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Transfiera todo el contenido a un tubo de centrífuga de 15 ml y gírelo a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Decantar suavemente el sobrenadante en un contenedor de residuos y volver a suspender el gránulo en 6 ml de DMEM tibio + 10% de FBS. Inmediatamente después de la resuspensión, transfiera 10 μL de células HT-29 suspendidas desde el centro del cultivo a un tubo de PCR de 0,2 mL. Añadir 10 μL de colorante azul de tripano al tubo de PCR y mezclar. Agregue 10 μL de mezcla de celda HT-29 / azul de tripano a un portaobjetos desechable de la cámara de contador de celdas Countess (consulte la Tabla de materiales). Enumere el número de células vivas y calcule la viabilidad de las células.NOTA: Al documentar el número de células en la muestra, lea el número debajo del recuento de células “vivas”, no el recuento total de células. Alternativamente, la enumeración de células se puede realizar manualmente utilizando un hemocitómetro. La semilla resuspendió las células HT-29 en un matraz T75 fresco o en una placa de 6 pocillos.Para matraz T75:Pipetear suavemente para mezclar, luego transferir 2,5 x 106 celdas a un matraz T75 nuevo de acuerdo con la siguiente ecuación: Agregue DMEM caliente + 10% de medios FBS a un volumen final de 20 ml (concentración final de 1,25 x 105 células/ml). Disperse las células de manera uniforme a lo largo del matraz balanceándolo suavemente hacia adelante y hacia atrás. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.NOTA: Para un crecimiento óptimo, reemplace el medio DMEM + 10% FBS en el matraz T75 cada ~ 3 días. Decantar los medios en un contenedor de residuos y añadir 10 ml de PBS tibio al matraz. Gire el PBS suavemente y decántelo en el contenedor de desechos. A continuación, añadir 20 ml de DMEM fresco y tibio + 10% de FBS al matraz y volver a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 . Para placa de 6 pocillos:Pipetear suavemente para mezclar, luego transferir 5.85 x 106 celdas a un tubo cónico nuevo de 50 mL de acuerdo con la siguiente ecuación: Añadir DMEM caliente + 10% de medios FBS hasta un volumen final de 26 mL (concentración final de 2,25 x 105 células/mL). Pipetear suavemente para mezclar, luego dispensar 2 ml (4,5 x 105 celdas) en pocillos individuales de placas de 6 pocillos. Disperse las células de manera uniforme a través del pocillo balanceándolas suavemente hacia arriba / abajo y hacia la izquierda / derecha 2-3x. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 80%-95% de confluencia (aproximadamente 3-4 días).NOTA: Se recomienda una confluencia del 85% para los ensayos de invasión y replicación intracelular, mientras que se recomienda una confluencia del 90%-95% para los ensayos de adherencia. Las células deben alcanzar una confluencia de ~85% después de 48 h de incubación con una concentración final de aproximadamente 1 x 106 células/pocillo. Es posible que se requieran ajustes en el número de células sembradas y la duración de la incubación. Fabricación de existencias HT-29 congeladasAlícuota de 1 ml de DMEM + 10% de FBS + 5% de DMSO en viales criogénicos individuales. Añadir 1 x 106 células HT-29 del paso 3.2.7 a cada vial. Calcule el volumen de las celdas de acuerdo con la siguiente fórmula: Almacene las celdas HT-29 a largo plazo por debajo de -130 °C en un congelador de almacenamiento de vapor de nitrógeno líquido. 4. Ensayo de adherencia NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos. Subcultivo durante la noche Cultivos de Shigella mediante dilución 1:50 en medios frescos.A continuación, agregue 100 μL de cada cultivo durante la noche a 5 mL de TSB fresco o TSB + BS en un tubo de cultivo de tamaño adecuado.NOTA: Limite el volumen de cultivo al <20% del volumen del matraz o tubo de cultivo para garantizar una aireación adecuada. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que las células alcancen una densidad óptica (DO600) de 0,7 (fase logarítmica media del crecimiento de Shigella ); alrededor de 2-2,5 h.NOTA: Durante el subcultivo, alícuota 50 mL de DMEM y un volumen suficiente de PBS para todos los pasos de lavado y colóquelo en un baño de agua a 37 °C. Deje que el medio alcance los 37 °C antes de su uso. Transfiera 2 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) subcultivadas de Shigella a tubos de microcentrífuga individuales de 2 mL.NOTA: 2 x 108 UFC corresponde aproximadamente a 1 ml de células bacterianas con un diámetro exterior de600 de 0,7. Utilice lecturas de OD600 para aproximar UFC/ml de acuerdo con la calibración de cada espectrofotómetro individual. Lave cada muestra de Shigella 2 veces con PBS.Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, luego agregar 1 mL de PBS tibio y resuspender bien el gránulo, pipeteando suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea completamente homogénea (8-10x). Repita el paso 4.3.1 1 vez más. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 2 mL de DMEM tibio.NOTA: La concentración final de bacterias resuspendidas será de 1 x 108 UFC/mL. A continuación, agregue 1 ml (1 x 108 UFC) de Shigella resuspendida a cada pocillo de las monocapas epiteliales colónicas HT-29 preparadas en placas de 6 pocillos (del paso 3.2.10.2).NOTA: Las infecciones se realizan normalmente con una multiplicidad de infecciones (MOI; proporción de células bacterianas y epiteliales) de 100. Para probar diferentes MOI, diluya Shigella resuspendida en DMEM tibio a la concentración deseada, luego agregue 1 ml de bacterias diluidas a las monocapas HT-29. Por ejemplo, para probar un MOI de 10, diluya las bacterias 1:10 agregando 150 μl de bacterias 1 x 108 UFC/ml a 1,35 ml de DMEM tibio y, a continuación, aplique 1 ml (1 x 107 UFC) a las células HT-29. Incubar las placas de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h. Durante la incubación, determine el título de infección bacteriana.Preparar diluciones seriadas 10 veces de células Shigella resuspendidas (del paso 4.3.3) en PBS. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-6 y 1 x 10-7, respectivamente. Después de la incubación, lavar las monocapas 4-5 veces con PBS.Aspire los medios de cada pocillo.NOTA: Al aspirar medios de placas de 6 pocillos, guíe la punta del aspirador a lo largo de la parte inferior de los pocillos, tratando de evitar el contacto con las celdas HT-29. Agregue 1 ml de PBS tibio a cada pocillo y lávelos suavemente.NOTA: Para lavar suavemente monocapas de 6 pocillos con PBS, mueva la placa hacia arriba y hacia abajo y de lado a lado sobre la mesa de trabajo. Lavar las placas con movimientos circulares y/o retirar la placa de la superficie de la mesa de trabajo puede provocar la eliminación mecánica de las células del plástico. Repita los pasos 4.7.1 y 4.7.2 4 veces más. Eliminar el PBS por aspiración y lisar las células HT-29 añadiendo 1 mL de PBS + 1% de Triton X-100 a cada pocillo. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C durante 5 min. Utilice un raspador de células o una punta de pipeta doblada para raspar las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera 1 ml completo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,7 ml. Determinar el número de bacterias asociadas a las células.Agitar cada tubo (a partir del paso 4.10) durante al menos 30 s para desplazar aún más a Shigella de las células eucariotas lisadas. Prepare diluciones seriadas 10 veces mayores de lisados en PBS. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 en placas TSB + rojo Congo e incubar durante la noche a 37 °C.NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-3, 1 x 10-4 y 1 x 10-5, respectivamente. 5. Ensayo de invasión NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos. Subcultivo durante la noche Cultivos de Shigella mediante dilución 1:50 en medios frescos.A continuación, agregue 100 μL de cada cultivo durante la noche a 5 mL de TSB fresco o TSB + BS en un tubo de cultivo de tamaño adecuado.NOTA: Limite el volumen de cultivo al <20% del volumen del matraz o tubo de cultivo para garantizar una aireación adecuada. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que las células alcancen un OD600 de 0,7 (fase logarítmica media del crecimiento de Shigella ); alrededor de 2-2,5 h.NOTA: Durante el subcultivo, alícuota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina y un volumen suficiente de PBS para todos los pasos de lavado y colóquelo en un baño de agua a 37 °C. Deje que el medio alcance los 37 °C antes de su uso. Transfiera 2 x 108 UFC subcultivadas Shigella a tubos de microcentrífuga individuales de 2 mL.NOTA: 2 x 108 UFC corresponde aproximadamente a 1 ml de células bacterianas con un diámetro exterior de600 de 0,7. Utilice lecturas de OD600 para aproximar UFC/ml de acuerdo con la calibración de cada espectrofotómetro individual. Lave las muestras de Shigella 1 vez con PBS.Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, luego agregar 1 mL de PBS tibio y resuspender bien el gránulo, pipeteando suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea completamente homogénea (8-10x). Repita el paso 5.3.1. 1 vez más tiempo. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 2 mL de DMEM tibio.NOTA: La concentración final de bacterias resuspendidas será de 1 x 108 UFC/mL. Vórtice, luego agregue 1 mL (1 x 108 UFC) de Shigella resuspendida más 1 mL de DMEM a cada pocillo de las monocapas epiteliales colónicas HT-29 preparadas en placas de 6 pocillos (del paso 3.2.10.2).NOTA: Las infecciones se realizan normalmente con una multiplicidad de infecciones (MOI; proporción de células bacterianas y epiteliales) de 100. Para probar diferentes MOI, diluya Shigella resuspendida en DMEM a la concentración deseada, luego agregue 1 ml de bacterias diluidas a las monocapas HT-29. Por ejemplo, para probar un MOI de 10, diluya las bacterias 1:10 agregando 150 μL de bacterias 1 x 108 UFC/ml a 1,35 ml de DMEM, luego agregue 1 ml (1 x 107 UFC) a las células HT-29. Para promover el contacto bacteriano con las células HT-29, centrifugue las placas de 6 pocillos a 2.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente o 37 °C si se puede ajustar el ajuste de temperatura.NOTA: La centrifugación promueve el contacto bacteriano con las células HT-29, lo que evita la necesidad de factores de adherencia y permite que las bacterias invadan rápidamente las células. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 45 min. Durante la incubación, determine el título de infección bacteriana.Preparar diluciones seriadas 10 veces de células Shigella resuspendidas (del paso 5.3.3) en PBS. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-6 y 1 x 10-7, respectivamente. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.Aspire los medios de cada pocillo.NOTA: Al aspirar medios de placas de 6 pocillos, guíe la punta del aspirador a lo largo de la parte inferior de los pocillos, tratando de evitar el contacto con las celdas HT-29. Agregue 1 ml de PBS tibio a cada pocillo y lávelos suavemente.NOTA: Para lavar suavemente monocapas de 6 pocillos con PBS, mueva la placa hacia arriba y hacia abajo y de lado a lado sobre la mesa de trabajo. Lavar las placas con movimientos circulares y/o retirar la placa de la superficie de la mesa de trabajo puede provocar la eliminación mecánica de las células del plástico. Repita los pasos 5.8.1 y 5.8.2 2 veces más. Eliminar el PBS por aspiración, añadir 2 ml de DMEM tibio suplementado con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.Repita el paso de lavado 5.8. Eliminar el PBS por aspiración, añadir 2 ml de DMEM tibio suplementado con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo e incubar durante 60 min a 37 °C con 5% de CO2. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.Repita el paso de lavado 5.8. Eliminar el PBS por aspiración y lisar las células HT-29 añadiendo 1 mL de PBS + 1% de Triton X-100 a cada pocillo. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C durante 5 min. Utilice un raspador de células o una punta de pipeta doblada para raspar las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera 1 ml completo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,7 ml. Determinar el número de bacterias intracelulares.Agitar cada tubo (a partir del paso 5.15) durante al menos 30 s para desplazar aún más a Shigella de las células eucariotas lisadas. Prepare diluciones seriadas 10 veces mayores de lisados en PBS. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-2 y 1 x 10-3 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-2 y 1 x 10-3 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-3 y 1 x 10-4, respectivamente. 6. Ensayo de replicación intracelular NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos. Subcultivo durante la noche Cultivos de Shigella mediante dilución 1:50 en medios frescos.A continuación, agregue 100 μL de cada cultivo durante la noche a 5 mL de TSB fresco o TSB + BS en un tubo de cultivo de tamaño adecuado.NOTA: Limite el volumen de cultivo al <20% del volumen del matraz o tubo de cultivo para garantizar una aireación adecuada. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm hasta que las células alcancen un OD600 de 0,7 (fase logarítmica media del crecimiento de Shigella ); alrededor de 2-2,5 h.NOTA: Durante el subcultivo, alícuota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina y un volumen suficiente de PBS para todos los pasos de lavado y colóquelo en un baño de agua a 37 °C. Deje que el medio alcance los 37 °C antes de su uso. Transfiera 2 x 108 UFC subcultivadas Shigella a tubos de microcentrífuga individuales de 2 mL.NOTA: 2 x 108 UFC corresponde aproximadamente a 1 ml de células bacterianas con un diámetro exterior de600 de 0,7. Utilice lecturas de OD600 para aproximar UFC/ml de acuerdo con la calibración de cada espectrofotómetro individual. Lave las muestras de Shigella 1 vez con PBS.Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, luego agregar 1 mL de PBS tibio y resuspender bien el gránulo, pipeteando suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea completamente homogénea (8-10x). Repita el paso 6.3.1. 1 vez más tiempo. Células de pellets por centrifugación a 17.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 2 mL de DMEM tibio.NOTA: La concentración final de bacterias resuspendidas será de 1 x 108 UFC/mL. Vórtice, luego agregue 1 mL (1 x 108 UFC) de Shigella resuspendida más 1 mL de DMEM a cada pocillo de monocapas epiteliales colónicas HT-29 preparadas en placas de 6 pocillos (del paso 3.2.10.2).NOTA: Las infecciones se realizan normalmente con una multiplicidad de infecciones (MOI; proporción de células bacterianas y epiteliales) de 100. Para probar diferentes MOI, diluya Shigella resuspendida en DMEM a la concentración deseada, luego agregue 1 ml de bacterias diluidas a las monocapas HT-29. Por ejemplo, para probar un MOI de 10, diluya las bacterias 1:10 agregando 150 μl de bacterias 1 x 108 UFC/ml a 1,35 ml de DMEM, luego aplique 1 ml (1 x 107 UFC) a las células HT-29. Para promover el contacto bacteriano con las células HT-29, centrifugue las placas de 6 pocillos a 2.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente o 37 °C si se puede ajustar el ajuste de temperatura.NOTA: La centrifugación promueve el contacto bacteriano con las células HT-29, lo que evita la necesidad de factores de adherencia y permite que las bacterias invadan rápidamente las células. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 45 min. Durante la incubación, determine el título de infección bacteriana.Prepare diluciones seriadas 10 veces de células Shigella resuspendidas (del paso 6.3.3) en PBS. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 en placas TSB + Congo rojo e incubar durante la noche a 37 °C.NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-5 y 1 x 10-6 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-6 y 1 x 10-7, respectivamente. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.Aspire los medios de cada pocillo.NOTA: Al aspirar medios de placas de 6 pocillos, guíe la punta del aspirador a lo largo de la parte inferior de los pocillos, tratando de evitar el contacto con las celdas HT-29. Agregue 1 ml de PBS tibio a cada pocillo y lávelos suavemente.NOTA: Para lavar suavemente monocapas de 6 pocillos con PBS, mueva la placa hacia arriba y hacia abajo y de lado a lado sobre la mesa de trabajo. Lavar las placas con movimientos circulares y/o retirar la placa de la superficie de la mesa de trabajo puede provocar la eliminación mecánica de las células del plástico. Repita los pasos 6.8.1 y 6.8.2 2 veces más. Eliminar el PBS por aspiración, añadir 2 ml de DMEM tibio suplementado con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2. Lave bien las células HT-29 infectadas 3 veces con 1 ml de PBS.Repita el paso de lavado 6.8. Eliminar el PBS por aspiración, luego añadir 2 ml de DMEM tibio con 50 μg/ml de gentamicina a cada pocillo de las placas de 6 pocillos e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante el tiempo deseado para permitir la replicación intracelular (hasta 24 h). Lave bien las células 2 veces con 1 ml de PBS.Repita el paso de lavado 6.8. Eliminar el PBS por aspiración y lisar las células HT-29 añadiendo 1 mL de PBS + 1% de Triton X-100 a cada pocillo. Incubar placas de 6 pocillos a 37 °C durante 5 min. Utilice un raspador de células o una punta de pipeta doblada para raspar las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera el 1 ml completo a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,7 ml. Determinar el número de bacterias intracelulares.Agite cada tubo (a partir del paso 6.15) durante al menos 30 s para desplazar aún más Shigella de las células eucariotas lisadas. Prepare diluciones seriadas 10 veces mayores de lisados en PBS. Colocar 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 en placas TSB + Congo Red e incubar durante la noche a 37 °C.NOTA: El recubrimiento de 100 μL de las diluciones 1 x 10-2, 1 x 10-3 y 1 x 10-4 corresponde a un factor de dilución final de 1 x 10-3, 1 x 10-4 y 1 x 10-5, respectivamente.