AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

O sequenciamento de próxima geração (NGS), também conhecido como sequenciamento massivamente paralelo, é uma tecnologia de sequenciamento de DNA que envolve fragmentação de DNA, ligação de oligonucleotídeos adaptadores, amplificação baseada em reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento do DNA e remontagem das sequências de fragmentos em um genoma. A adaptação do NGS ao RNA de sequência (RNA-seq) é uma abordagem poderosa para identificar e quantificar transcritos de RNA e suas variantes¹. Desenvolvimentos inovadores nos fluxos de trabalho de preparação de bibliotecas de RNA e pipelines de análise bioinformática, juntamente com avanços na instrumentação laboratorial, expandiram o repertório de aplicações de RNA-seq, progredindo além do sequenciamento do exoma para ômicas funcionais avançadas, como perfil de RNA não codificante², análise de célula única³, transcriptômica espacial ^4,5, análise de splicing alternativa⁶, entre outros. Esses métodos avançados de RNA-seq revelam funções complexas de RNA por meio da análise quantitativa do transcriptoma em células e tecidos normais e doentes.

Apesar desses avanços no RNA-seq, várias características técnicas importantes limitam o poder quantitativo do método. Embora a maioria dos métodos de RNA-seq permita a quantificação precisa e exata das mudanças nos níveis de RNAs entre variáveis experimentais (ou seja, amostras biológicas e/ou estados fisiológicos), eles não podem fornecer comparações quantitativas dos níveis de moléculas de RNA dentro de uma amostra. Por exemplo, a maioria dos métodos de RNA-seq não pode quantificar com precisão o número relativo de cópias de moléculas isoaceitadoras de tRNA individuais em um pool celular de tRNAs expressos. Conforme destacado na publicação complementar⁷, essa limitação ao RNA-seq surge de várias características da estrutura do RNA e da bioquímica da preparação da biblioteca. Por exemplo, a atividade das enzimas de ligação usadas para ligar os ligantes de sequenciamento de extremidade 3′ e 5′ às moléculas de RNA é fortemente influenciada pela identidade dos nucleotídeos terminais do RNA e dos ligantes de sequenciamento. Isso leva a grandes variações nas eficiências das ligações de ligantes e profundos aumentos artefactuais nas leituras de sequenciamento ^8,9,10.

Um segundo conjunto de limitações surge das propriedades estruturais inerentes das moléculas de RNA. Especificamente, a formação da estrutura secundária do RNA e as mudanças dinâmicas nas dezenas de modificações pós-transcricionais do RNA do epitranscriptoma podem causar queda ou mutação da polimerase durante a transcrição reversa. Esses erros resultam em síntese de cDNA incompleta ou truncada ou sequência de RNA alterada. Embora ambos os fenômenos possam ser explorados para mapear estruturas secundárias ou algumas modificações, eles degradam a precisão quantitativa do RNA-seq se as etapas subsequentes de preparação da biblioteca falharem em capturar cDNAs truncados ou se o processamento de dados descartar sequências mutantes que não correspondem a um conjunto de dados de referência^{11 , 12} . Além disso, a imensa diversidade química, de comprimento e estrutural dos transcritos de RNA, bem como a falta de ferramentas para fragmentar uniformemente RNAs longos, diminui a aplicabilidade da maioria dos métodos de RNA-seq a todas as espécies de RNA¹³.

O método AQRNA-seq (sequenciamento de RNA de quantificação absoluta) foi desenvolvido para remover várias dessas restrições técnicas e biológicas que limitam a precisão quantitativa⁷. Ao minimizar os vieses dependentes de sequência na captura, ligação e amplificação durante a preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA, o AQRNA-seq atinge linearidade superior em comparação com outros métodos, quantificando com precisão 75% de uma biblioteca de referência de 963 miRNAs com precisão de 2 vezes. Essa correlação linear de sequenciamento, contagem de leitura e abundância de RNA também é observada em uma análise de um conjunto de comprimentos variáveis de padrões de oligonucleotídeos de RNA e em referência a métodos ortogonais como northern blotting. Estabelecer linearidade entre a contagem de leitura de sequenciamento e a abundância de RNA permite que o AQRNA-seq alcance uma quantificação precisa e absoluta de todas as espécies de RNA em uma amostra.

Aqui está uma descrição do protocolo para o fluxo de trabalho de preparação da biblioteca AQRNA-seq e o pipeline de análise de dados downstream que o acompanha. O método foi aplicado para elucidar a dinâmica da abundância de tRNA durante a dormência induzida pela fome e subsequente ressuscitação no modelo de tuberculose Mycobacterium bovis bacilos de Calmette et Guérin (BCG). Os resultados foram apresentados para a visualização exploratória dos dados de sequenciamento, juntamente com análises subsequentes de agrupamento e expressão diferencial que revelaram padrões discerníveis na abundância de tRNA associados a vários fenótipos.