AQRNA-seq لقياس كمية الحمض النووي الريبي الصغير
Summary
تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق (AQRNA-seq) هو تقنية تم تطويرها لتحديد المناظر الطبيعية لجميع الحمض النووي الريبي الصغير في الخلائط البيولوجية. هنا ، يتم عرض كل من خطوات إعداد المكتبة ومعالجة البيانات الخاصة ب AQRNA-seq ، وتحديد التغيرات في تجمع الحمض النووي الريبي الناقل (tRNA) في المتفطرة البوفية BCG أثناء السكون الناجم عن الجوع.
Abstract
يوفر AQRNA-seq علاقة خطية مباشرة بين تسلسل عدد قراءات وأرقام نسخ الحمض النووي الريبي الصغيرة في عينة بيولوجية ، مما يتيح القياس الكمي الدقيق لمجموعة الحمض النووي الريبي الصغير. يتضمن إجراء إعداد مكتبة AQRNA-seq الموصوف هنا استخدام روابط تسلسل مصممة خصيصا وخطوة لتقليل تعديلات الحمض النووي الريبي المثيلي التي تمنع عملية النسخ العكسي ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية cDNAs كاملة الطول. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تنفيذ مفصل لخط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصاحب. تم إجراء هذا العرض التوضيحي ل AQRNA-seq من خلال تحليل كمي ل 45 tRNAs في المتفطرة البوفية BCG التي تم حصادها في 5 أيام مختارة عبر دورة زمنية مدتها 20 يوما من الحرمان من المغذيات و 6 أيام من الإنعاش. كما سيتم مناقشة الجهود الجارية لتحسين كفاءة ودقة AQRNA-seq هنا. يتضمن ذلك استكشاف طرق لتجنب تنقية الجل للتخفيف من مشكلات dimer التمهيدي بعد تضخيم PCR وزيادة نسبة القراءات كاملة الطول لتمكين تعيين قراءة أكثر دقة. ستركز التحسينات المستقبلية على AQRNA-seq على تسهيل الأتمتة والتنفيذ عالي الإنتاجية لهذه التكنولوجيا لتحديد جميع أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة في عينات الخلايا والأنسجة من الكائنات الحية المتنوعة.
Introduction
تسلسل الجيل التالي (NGS) ، المعروف أيضا باسم التسلسل المتوازي على نطاق واسع ، هو تقنية تسلسل الحمض النووي التي تتضمن تجزئة الحمض النووي ، وربط قليل النيوكليوتيدات المحول ، والتضخيم القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتسلسل الحمض النووي ، وإعادة تجميع تسلسل الشظايا في الجينوم. يعد تكييف NGS مع تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) نهجا قويا لتحديد وقياس نسخ الحمض النووي الريبي ومتغيراتها1. أدت التطورات المبتكرة في سير عمل إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي وخطوط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية ، إلى جانب التقدم في الأجهزة المختبرية ، إلى توسيع ذخيرة تطبيقات RNA-seq ، والتقدم إلى ما بعد تسلسل الإكسوم إلى omics وظيفية متقدمة مثل تنميط الحمض النووي الريبي غير المشفر2 ، تحليل الخلية الواحدة3 ، علم النسخ المكاني 4,5 ، تحليل الربط البديل6، من بين أمور أخرى. تكشف طرق RNA-seq المتقدمة هذه عن وظائف الحمض النووي الريبي المعقدة من خلال التحليل الكمي للنسخ في الخلايا والأنسجة الطبيعية والمريضة.
على الرغم من هذه التطورات في RNA-seq ، فإن العديد من الميزات التقنية الرئيسية تحد من القوة الكمية للطريقة. في حين أن معظم طرق RNA-seq تسمح بالقياس الكمي الدقيق والدقيق للتغيرات في مستويات الحمض النووي الريبي بين المتغيرات التجريبية (أي العينات البيولوجية و / أو الحالات الفسيولوجية) ، فإنها لا يمكن أن توفر مقارنات كمية لمستويات جزيئات الحمض النووي الريبي داخل العينة. على سبيل المثال ، لا يمكن لمعظم طرق RNA-seq تحديد العدد النسبي لنسخ جزيئات متقبلات tRNA الفردية بدقة في مجموعة خلوية من tRNAs المعبر عنها. كما هو موضح في المنشور المصاحب7 ، ينشأ هذا القيد على RNA-seq من العديد من ميزات بنية الحمض النووي الريبي والكيمياء الحيوية لإعداد المكتبة. على سبيل المثال ، يتأثر نشاط إنزيمات الربط المستخدمة لربط روابط تسلسل النهاية 3 و 5 بجزيئات الحمض النووي الريبي بشدة بهوية النيوكليوتيدات الطرفية للحمض النووي الريبي وروابط التسلسل. وهذا يؤدي إلى اختلافات كبيرة في كفاءات روابط الروابط والزيادات الأثرية العميقة في التسلسل يقرأ8،9،10.
تنشأ مجموعة ثانية من القيود من الخصائص الهيكلية المتأصلة لجزيئات الحمض النووي الريبي. على وجه التحديد ، يمكن أن يتسبب تكوين بنية الحمض النووي الريبي الثانوية والتغيرات الديناميكية في العشرات من تعديلات الحمض النووي الريبي بعد النسخ في حدوث خلل في البلمرة أو طفرة أثناء النسخ العكسي. تؤدي هذه الأخطاء إلى تخليق cDNA غير مكتمل أو مقطوع أو تسلسل RNA متغير. في حين يمكن استغلال هاتين الظاهرتين لتعيين الهياكل الثانوية أو بعض التعديلات ، إلا أنهما تتدهوران الدقة الكمية ل RNA-seq إذا فشلت خطوات إعداد المكتبة اللاحقة في التقاط cDNAs المقطوعة أو إذا أدت معالجة البيانات إلى التخلص من التسلسلات المتحولة التي لا تتطابق مع مجموعة البيانات المرجعية11،12. علاوة على ذلك ، فإن التنوع الكيميائي والطول والهيكل الهائل لنسخ الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى نقص الأدوات اللازمة لتفتيت الحمض النووي الريبي الطويل بشكل موحد ، يقلل من قابلية تطبيق معظم طرق RNA-seq على جميع أنواع الحمض النووي الريبي13.
تم تطوير طريقة AQRNA-seq (تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق) لإزالة العديد من هذه القيود التقنية والبيولوجية التي تحد من الدقة الكمية7. من خلال تقليل التحيزات المعتمدة على التسلسل في الالتقاط والربط والتضخيم أثناء إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي ، يحقق AQRNA-seq خطية فائقة مقارنة بالطرق الأخرى ، حيث يحدد بدقة 75٪ من مكتبة مرجعية من 963 miRNAs بدقة 2 ضعف. لوحظ هذا الارتباط الخطي لعدد قراءات التسلسل ووفرة الحمض النووي الريبي أيضا في تحليل مجموعة متغيرة الطول من معايير قليل النوكليوتيد الحمض النووي الريبي وفي إشارة إلى الطرق المتعامدة مثل النشاف الشمالي. إن تحديد الخطية بين عدد قراءات التسلسل ووفرة الحمض النووي الريبي يمكن AQRNA-seq من تحقيق تقدير كمي دقيق ومطلق لجميع أنواع الحمض النووي الريبي داخل العينة.
فيما يلي وصف لبروتوكول سير عمل إعداد مكتبة AQRNA-seq وخط أنابيب تحليلات البيانات المصاحب لها. تم تطبيق الطريقة لتوضيح ديناميات وفرة الحمض النووي الريبي أثناء السكون الناجم عن الجوع والإنعاش اللاحق في نموذج المتفطرة البوفية عصيات دي كالميت وغيران (BCG) لمرض السل. تم تقديم النتائج للتصور الاستكشافي لبيانات التسلسل ، جنبا إلى جنب مع تحليلات التجميع والتعبير التفاضلي اللاحقة التي كشفت النقاب عن أنماط يمكن تمييزها في وفرة tRNA المرتبطة بالأنماط الظاهرية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم سير عمل إعداد مكتبة AQRNA-seq لزيادة التقاط الحمض النووي الريبي داخل العينة وتقليل سقوط البلمرة أثناء النسخ العكسي7. من خلال ربط رابط من خطوتين ، يتم ربط oligos DNA الجديد (Linker 1 و Linker 2) بشكل زائد لاستكمال الحمض النووي الريبي بالكامل داخل العينة. يمكن إزالة الروابط الزائدة بكفا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعرب مؤلفو هذا العمل عن امتنانهم لمؤلفي الورقة الأصلية التي تصف تقنية AQRNA-seq7. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (ES002109 ، AG063341 ، ES031576 ، ES031529 ، ES026856) والمؤسسة الوطنية للبحوث في سنغافورة من خلال تحالف سنغافورة ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للبحث والتكنولوجيا مقاومة مضادات الميكروبات IRG.
Materials
| 2-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | 75890 | Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2938C | |
| 5'-deadenylase (50 U/μL) | New England Biolabs | M0331S (component #: M0331SVIAL) | Store at -20 °C |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | M0437M (component #: N0437AVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
| AGAROSE GPG/LE | AmericanBio | AB00972-00500 | Store at ambient temperature |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F2262 | Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C |
| Bioanalyzer Small RNA Analysis | Agilent | 5067-1548 | The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation) |
| Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) | New England Biolabs | B9000 | This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200). |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4441-10 | |
| Demethylase | ArrayStar | AS-FS-004 | Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004) |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L (component #: N0447LVIAL) | This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each) |
| Digital Dual Heat Block | VWR Scientific Products | 13259-052 | Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
| DyeEx 2.0 Spin Kit | Qiagen | 63204 | Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length) |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad Labrotories | PowerPac 300 | |
| Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 0030124537 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 022363611 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 022363204 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL) | Eppendorf | 022363352 | |
| Ethyl alcohol (Ethanol), Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research |
| Gel Imaging System | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS | New England Biolabs | N0556S (component #: B7025SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
| GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840-309000 | The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Scientific Products | BDH3028 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
| Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure | Macron Fine Chemicals | 3032-16 | Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L (component #: B7002SVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| Oligo Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4061 | Store at ambient temperature |
| PEG 8000 (50% solution) | New England Biolabs | M0437M (component #: B1004SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
| Peltier Thermal Cycler | MJ Research | PTC-200 | |
| Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 | Thermo Fisher Scientific | J62336 | |
| PrimeScript Buffer (5X) | TaKaRa | 2680A | |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | TaKaRa | 2680A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | This kit requires a heating block and isopropanol to work with |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0551S (component #: N0551SVIAL) | |
| Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0556S (component #: N0556SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
| RecJf (30 U/μL) | New England Biolabs | M0264L (component #: M0264LVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
| RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) | New England Biolabs | M0314L (component #: M0314LVIAL) | Store at -20 °C |
| SeqAMP DNA Polymerase | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| SeqAMP PCR Buffer (2X) | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | New England Biolabs | M0371L (component #: M0371LVIAL) | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
| T4 DNA Ligase (400 U/μL) | New England Biolabs | M0202L (component #: M0202LVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0202L (component #: B0202SVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) | New England Biolabs | M0437M (component #: M0437MVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
| T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0437M (component #: B0216SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
References
- Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
- Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.". J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
- Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
- Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
- Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209 (2017).
- Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
- Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049 (2015).
- Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170 (2014).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
- García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939 (2022).
- . FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2022).
- Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
- Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).
