AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

La secuenciación de próxima generación (NGS), también conocida como secuenciación paralela masiva, es una tecnología de secuenciación de ADN que implica la fragmentación del ADN, la ligadura de oligonucleótidos adaptadores, la amplificación basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la secuenciación del ADN y el reensamblaje de las secuencias de fragmentos en un genoma. La adaptación de NGS a la secuencia de ARN (RNA-seq) es un enfoque poderoso para identificar y cuantificar las transcripciones de ARN y sus variantes¹. Los desarrollos innovadores en los flujos de trabajo de preparación de bibliotecas de ARN y las tuberías de análisis bioinformático, junto con los avances en la instrumentación de laboratorio, han ampliado el repertorio de aplicaciones de secuenciación de ARN, progresando más allá de la secuenciación del exoma hacia ómicas funcionales avanzadas como el perfil de ARN no codificante², el análisis de células individuales³, la transcriptómica espacial ^4,5, el análisis de empalme alternativo⁶entre otros. Estos métodos avanzados de secuenciación de ARN revelan funciones complejas de ARN a través del análisis cuantitativo del transcriptoma en células y tejidos normales y enfermos.

A pesar de estos avances en la secuenciación de ARN, varias características técnicas clave limitan el poder cuantitativo del método. Si bien la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN permiten una cuantificación precisa y precisa de los cambios en los niveles de ARN entre variables experimentales (es decir, muestras biológicas y/o estados fisiológicos), no pueden proporcionar comparaciones cuantitativas de los niveles de moléculas de ARN dentro de una muestra. Por ejemplo, la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN no pueden cuantificar con precisión el número relativo de copias de moléculas isoaceptoras de ARNt individuales en un grupo celular de ARNt expresados. Como se destaca en la publicación complementaria⁷, esta limitación a la secuenciación de ARN surge de varias características de la estructura del ARN y la bioquímica de la preparación de la biblioteca. Por ejemplo, la actividad de las enzimas de ligadura utilizadas para unir los enlazadores de secuenciación de los extremos 3′ y 5′ a las moléculas de ARN está fuertemente influenciada por la identidad de los nucleótidos terminales del ARN y los enlazadores de secuenciación. Esto conduce a grandes variaciones en la eficiencia de las ligaduras de enlazadores y profundos aumentos artifactuales en las lecturas de secuenciación ^8,9,10.

Un segundo conjunto de limitaciones surgen de las propiedades estructurales inherentes de las moléculas de ARN. Específicamente, la formación de la estructura secundaria del ARN y los cambios dinámicos en las docenas de modificaciones postranscripcionales del ARN del epitranscriptoma pueden causar la caída de la polimerasa o la mutación durante la transcripción inversa. Estos errores dan lugar a una síntesis de ADNc incompleta o truncada o a una secuencia de ARN alterada. Si bien ambos fenómenos pueden explotarse para mapear estructuras secundarias o algunas modificaciones, degradan la precisión cuantitativa de la secuenciación de ARN si los pasos posteriores de preparación de la biblioteca no logran capturar ADNc truncados o si el procesamiento de datos arroja secuencias mutadas que no coinciden con un conjunto de datos de referencia^11,12. Además, la inmensa diversidad química, estructural y de longitud de los transcritos de ARN, así como la falta de herramientas para fragmentar uniformemente los ARN largos, disminuye la aplicabilidad de la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN a todas las especies de ARN¹³.

El método AQRNA-seq (secuenciación de ARN de cuantificación absoluta) se ha desarrollado para eliminar varias de estas restricciones técnicas y biológicas que limitan la precisión cuantitativa⁷. Al minimizar los sesgos dependientes de la secuencia en la captura, ligadura y amplificación durante la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN, AQRNA-seq logra una linealidad superior en comparación con otros métodos, cuantificando con precisión el 75% de una biblioteca de referencia de 963 miARN con una precisión de 2 veces. Esta correlación lineal entre el recuento de lecturas de secuenciación y la abundancia de ARN también se observa en un análisis de un grupo de longitud variable de estándares de oligonucleótidos de ARN y en referencia a métodos ortogonales como el Northern blot. El establecimiento de la linealidad entre el recuento de lecturas de secuenciación y la abundancia de ARN permite a AQRNA-seq lograr una cuantificación precisa y absoluta de todas las especies de ARN dentro de una muestra.

A continuación, se muestra una descripción del protocolo para el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca AQRNA-seq y la canalización de análisis de datos descendente que lo acompaña. El método se aplicó para dilucidar la dinámica de la abundancia de ARNt durante la latencia inducida por inanición y la posterior reanimación en el modelo de tuberculosis Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Se presentaron los resultados para la visualización exploratoria de los datos de secuenciación, junto con los posteriores análisis de agrupamiento y expresión diferencial que revelaron patrones discernibles en la abundancia de ARNt asociados con varios fenotipos.