מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי
Summary
אנו מתארים שיטה לחקור כיצד pH מגיב לרמזים סביבתיים בגליקוזיומים של צורת זרם הדם של טריפנוזומים אפריקאים. גישה זו כוללת חיישן חלבון תורשתי רגיש ל- pH בשילוב עם ציטומטריית זרימה למדידת דינמיקת pH, הן כבדיקת מסלול זמן והן בפורמט מסך בתפוקה גבוהה.
Abstract
מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי עבור טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei, כתהליך מטבולי חיוני ומווסת של התפתחות טפילים. מעט ידוע על התגובות התאיות שנוצרות כאשר רמות הגלוקוז בסביבה משתנות. הן בטפילים של זרם הדם והן בצורה פרוציקלית (שלב החרקים), גליקוזים מאכלסים את רוב הגליקוליזה. אברונים אלה חומציים במהירות בתגובה למחסור בגלוקוז, מה שככל הנראה גורם לוויסות אלוסטרי של אנזימים גליקוליטיים כגון הקסוקינז. בעבודה קודמת, לוקליזציה של הגשושית הכימית המשמשת לביצוע מדידות pH הייתה מאתגרת, והגבילה את התועלת שלה ביישומים אחרים.
מאמר זה מתאר את התפתחותם והשימוש בטפילים המבטאים pHluorin2 מקומי גליקוסומלי, חלבון תורשתי pH biosensor. pHluorin2 הוא וריאנט pHluorin יחסימטרי המציג ירידה תלוית pH (חומצה) בעירור ב 395 ננומטר ובו זמנית מניב עלייה בעירור ב 475 ננומטר. טפילים טרנסגניים נוצרו על ידי שיבוט מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 לתוך וקטור ביטוי טריפנוזום pLEW100v5, המאפשר ביטוי חלבון מושרה בכל אחד משלבי מחזור החיים. Immunofluorescence שימש כדי לאשר את הלוקליזציה הגליקוזומלית של biosensor pHluorin2, השוואת לוקליזציה של biosensor לחלבון תושב glycosomal aldolase. תגובתיות החיישן כוילה ברמות pH שונות על ידי דגירה של תאים בסדרה של מאגרים שנעו ב-pH בין 4 ל-8, גישה בה השתמשנו בעבר כדי לכייל חיישן pH מבוסס פלואורסצאין. לאחר מכן מדדנו פלואורסצנטיות pHluorin2 ב-405 ננומטר וב-488 ננומטר באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע pH גליקזומלי. תיקפנו את הביצועים של הטפילים החיים המבטאים pHluorin2 מהונדס, תוך ניטור pH לאורך זמן בתגובה למחסור בגלוקוז, גורם ידוע להחמצה גליקוזומלית בטפילי PF. לכלי זה יש מגוון יישומים פוטנציאליים, כולל שימוש פוטנציאלי בסינון תרופות בתפוקה גבוהה. מעבר ל-pH גליקזומלי, ניתן להתאים את החיישן לאברונים אחרים או להשתמש בו בטריפנוזומטים אחרים כדי להבין את דינמיקת ה-pH בסביבת התא החי.
Introduction
קינטופלסטים טפיליים, כמו רוב האורגניזמים החיים, מסתמכים על גלוקוז כמרכיב בסיסי במטבוליזם המרכזי של פחמן. קבוצה זו כוללת אורגניזמים חשובים מבחינה רפואית, כגון טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei; הטריפנוזום האמריקאי, T. cruzi; וטפילים מהסוג לישמניה. מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי לצמיחת הטפילים בשלבי מחזור החיים הפתוגניים. לדוגמה, כאשר נמנע גלוקוז, צורת זרם הדם (BSF) של טריפנוזום אפריקאי מת במהירות. יש לציין כי גליקוליזה משמשת כמקור היחיד ל-ATP בשלב זה של זיהום1. טפילי לישמניה תלויים גם הם בגלוקוז בפונדקאי האנושי, כאשר שלב מחזור החיים של האמסטיגוט השוכן במקרופאגים של הפונדקאי מסתמך על מקור פחמן זה לגדילה2.
בעוד שלטפילים אלה יש אורח חיים שונה הכולל וקטורים שונים של חרקים, הם חולקים מאפיינים משותפים רבים באופן שבו הם מגיבים לגלוקוז וצורכים אותו. לדוגמה, טפילים אלה ממקמים את רוב האנזימים הגליקוליטיים לפרוקסיזומים מהונדסים הנקראים גליקוזימים. אברון קינטופלסטידים ספציפי זה קשור לפרוקסיזומים של יונקים בהתבסס על מנגנונים ביוסינתטיים שמורים ומורפולוגיה 3,4,5,6.
המידור של רוב אנזימי המסלול הגליקוליטי לתוך הגליקוזום מציע אמצעים ספציפיים לטפיל לוויסות המסלול. באמצעות בדיקת pH כימית, קבענו כי מחסור בחומרים מזינים מעורר החמצה מהירה של גליקוזימים של טפיל צורה פרוציקלית (PF), הגורמת לשינוי בפעילות האנזים הגליקוליטי באמצעות חשיפה של אתר קושר מווסת אלוסטרי על האנזים הגליקוליטי העיקרי הקסוקינאז 7,8. בעבודתנו הקודמת, הגשושית הכימית דרשה אספקה מתמדת לשימוש, מה שהגביל את התועלת שלה ביישומים אחרים. בנוסף, אתגרים בשמירה על התפלגות הגשושית בגליקוזום ב- BSF הגבילו את התועלת של הגישה לחקר pH גליקוזומלי בשלב חיים זה.
במחקר הזה השתמשנו בחלבון הפלואורסצנטי pHluorin2 כדי לעקוב אחר שינוי ב-pH גליקוזומלי ב-BSF T. brucei בתגובה לרמזים סביבתיים, כולל רעב גלוקוז9 (איור 1). תוצאות עבודה זו מצביעות על כך ש- BSF T. brucei חומצי גליקוזימים במהירות בתגובה לרעב באופן הפיך, בדומה לתגובות שראינו בטפילי PF. אנו מצפים שחיישן ביולוגי זה ישפר את הבנתנו את הוויסות הגליקוליטי ב – T. brucei ובטפילים קשורים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפיסה הסביבתית ומנגנוני התגובה בטריפנוזום האפריקאי אינם מובנים היטב. ידוע כי שינויים בזמינות החומרים המזינים מעוררים תגובות מגוונות בטפיל, כולל החמצה של גליקוזים. במאמר זה תיארנו שיטה לחקר תגובת pH גליקוזומלית להפרעות סביבתיות בתאים חיים באמצעות חיישן חלבון תורשתי, pHluorin2 וציטומטריית זר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 שוכפל לתוך pLEW100v5 על ידי Twist Bioscience שסיפקה את המבנה בווקטור שיבוט עתיר עותקים; pLEW100v5 היה מתנה מד”ר ג’ורג’ קרוס. אנטי-סרום שהועלה נגד T. brucei aldolase זמין מד”ר מרדית ט. מוריס, אוניברסיטת קלמסון, על פי בקשה. העבודה ממעבדות JCM ו- KAC נתמכה חלקית על ידי פרס מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01AI156382). SSP נתמך על ידי NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
- Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
- Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
- Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
- Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
- Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).
- Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- . Restriction digest v.2 Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018)
- . Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021)
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
- Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
- Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
- Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
- Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
- Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
- Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
- Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).
