We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.
מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי עבור טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei, כתהליך מטבולי חיוני ומווסת של התפתחות טפילים. מעט ידוע על התגובות התאיות שנוצרות כאשר רמות הגלוקוז בסביבה משתנות. הן בטפילים של זרם הדם והן בצורה פרוציקלית (שלב החרקים), גליקוזים מאכלסים את רוב הגליקוליזה. אברונים אלה חומציים במהירות בתגובה למחסור בגלוקוז, מה שככל הנראה גורם לוויסות אלוסטרי של אנזימים גליקוליטיים כגון הקסוקינז. בעבודה קודמת, לוקליזציה של הגשושית הכימית המשמשת לביצוע מדידות pH הייתה מאתגרת, והגבילה את התועלת שלה ביישומים אחרים.
מאמר זה מתאר את התפתחותם והשימוש בטפילים המבטאים pHluorin2 מקומי גליקוסומלי, חלבון תורשתי pH biosensor. pHluorin2 הוא וריאנט pHluorin יחסימטרי המציג ירידה תלוית pH (חומצה) בעירור ב 395 ננומטר ובו זמנית מניב עלייה בעירור ב 475 ננומטר. טפילים טרנסגניים נוצרו על ידי שיבוט מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 לתוך וקטור ביטוי טריפנוזום pLEW100v5, המאפשר ביטוי חלבון מושרה בכל אחד משלבי מחזור החיים. Immunofluorescence שימש כדי לאשר את הלוקליזציה הגליקוזומלית של biosensor pHluorin2, השוואת לוקליזציה של biosensor לחלבון תושב glycosomal aldolase. תגובתיות החיישן כוילה ברמות pH שונות על ידי דגירה של תאים בסדרה של מאגרים שנעו ב-pH בין 4 ל-8, גישה בה השתמשנו בעבר כדי לכייל חיישן pH מבוסס פלואורסצאין. לאחר מכן מדדנו פלואורסצנטיות pHluorin2 ב-405 ננומטר וב-488 ננומטר באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע pH גליקזומלי. תיקפנו את הביצועים של הטפילים החיים המבטאים pHluorin2 מהונדס, תוך ניטור pH לאורך זמן בתגובה למחסור בגלוקוז, גורם ידוע להחמצה גליקוזומלית בטפילי PF. לכלי זה יש מגוון יישומים פוטנציאליים, כולל שימוש פוטנציאלי בסינון תרופות בתפוקה גבוהה. מעבר ל-pH גליקזומלי, ניתן להתאים את החיישן לאברונים אחרים או להשתמש בו בטריפנוזומטים אחרים כדי להבין את דינמיקת ה-pH בסביבת התא החי.
קינטופלסטים טפיליים, כמו רוב האורגניזמים החיים, מסתמכים על גלוקוז כמרכיב בסיסי במטבוליזם המרכזי של פחמן. קבוצה זו כוללת אורגניזמים חשובים מבחינה רפואית, כגון טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei; הטריפנוזום האמריקאי, T. cruzi; וטפילים מהסוג לישמניה. מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי לצמיחת הטפילים בשלבי מחזור החיים הפתוגניים. לדוגמה, כאשר נמנע גלוקוז, צורת זרם הדם (BSF) של טריפנוזום אפריקאי מת במהירות. יש לציין כי גליקוליזה משמשת כמקור היחיד ל-ATP בשלב זה של זיהום1. טפילי לישמניה תלויים גם הם בגלוקוז בפונדקאי האנושי, כאשר שלב מחזור החיים של האמסטיגוט השוכן במקרופאגים של הפונדקאי מסתמך על מקור פחמן זה לגדילה2.
בעוד שלטפילים אלה יש אורח חיים שונה הכולל וקטורים שונים של חרקים, הם חולקים מאפיינים משותפים רבים באופן שבו הם מגיבים לגלוקוז וצורכים אותו. לדוגמה, טפילים אלה ממקמים את רוב האנזימים הגליקוליטיים לפרוקסיזומים מהונדסים הנקראים גליקוזימים. אברון קינטופלסטידים ספציפי זה קשור לפרוקסיזומים של יונקים בהתבסס על מנגנונים ביוסינתטיים שמורים ומורפולוגיה 3,4,5,6.
המידור של רוב אנזימי המסלול הגליקוליטי לתוך הגליקוזום מציע אמצעים ספציפיים לטפיל לוויסות המסלול. באמצעות בדיקת pH כימית, קבענו כי מחסור בחומרים מזינים מעורר החמצה מהירה של גליקוזימים של טפיל צורה פרוציקלית (PF), הגורמת לשינוי בפעילות האנזים הגליקוליטי באמצעות חשיפה של אתר קושר מווסת אלוסטרי על האנזים הגליקוליטי העיקרי הקסוקינאז 7,8. בעבודתנו הקודמת, הגשושית הכימית דרשה אספקה מתמדת לשימוש, מה שהגביל את התועלת שלה ביישומים אחרים. בנוסף, אתגרים בשמירה על התפלגות הגשושית בגליקוזום ב- BSF הגבילו את התועלת של הגישה לחקר pH גליקוזומלי בשלב חיים זה.
במחקר הזה השתמשנו בחלבון הפלואורסצנטי pHluorin2 כדי לעקוב אחר שינוי ב-pH גליקוזומלי ב-BSF T. brucei בתגובה לרמזים סביבתיים, כולל רעב גלוקוז9 (איור 1). תוצאות עבודה זו מצביעות על כך ש- BSF T. brucei חומצי גליקוזימים במהירות בתגובה לרעב באופן הפיך, בדומה לתגובות שראינו בטפילי PF. אנו מצפים שחיישן ביולוגי זה ישפר את הבנתנו את הוויסות הגליקוליטי ב – T. brucei ובטפילים קשורים.
Environmental perception and response mechanisms in the African trypanosome are poorly understood. Changes in nutrient availability are known to trigger diverse responses in the parasite, including acidification of glycosomes. Here, we have described a method to study glycosomal pH response to environmental perturbations in living cells using a heritable protein sensor, pHluorin2, and flow cytometry.
There are several critical steps in the use of the sensor. First, the characterization of tran…
The authors have nothing to disclose.
pHluorin2-PTS1 was cloned into pLEW100v5 by Twist Bioscience who provided the construct in a high-copy cloning vector; pLEW100v5 was a gift from Dr. George Cross. Antiserum raised against T. brucei aldolase is available from Dr. Meredith T. Morris, Clemson University, upon request. Work from the JCM and KAC laboratories was partially supported by an award from the National Institutes of Health (R01AI156382). SSP was supported by NIH 3R01AI156382.
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
GraphPad Prism | statistical software | ||
Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
For pH calibration | |||
For pH calibration |