قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي
Summary
وصفنا طريقة لدراسة كيفية استجابة الأس الهيدروجيني للإشارات البيئية في جليكوسومات مجرى الدم من المثقبيات الأفريقية. يتضمن هذا النهج مستشعر بروتين وراثي حساس لدرجة الحموضة مع قياس التدفق الخلوي لقياس ديناميكيات الأس الهيدروجيني ، سواء كفحص زمني أو في شكل شاشة عالية الإنتاجية.
Abstract
استقلاب الجلوكوز أمر بالغ الأهمية للمثقبيات الأفريقية ، المثقبية البروسية ، كعملية أيضية أساسية ومنظم لتطور الطفيليات. لا يعرف سوى القليل عن الاستجابات الخلوية المتولدة عندما تتغير مستويات الجلوكوز البيئية. في كل من مجرى الدم والطفيليات ذات الشكل الحلقي (مرحلة الحشرات) ، تحتوي الجليكوسومات على معظم تحلل السكر. يتم تحمض هذه العضيات بسرعة استجابة للحرمان من الجلوكوز ، مما يؤدي على الأرجح إلى التنظيم الخيفي للإنزيمات المحللة للسكر مثل هيكسوكيناز. في العمل السابق ، كان توطين المسبار الكيميائي المستخدم لإجراء قياسات الأس الهيدروجيني أمرا صعبا ، مما حد من فائدته في التطبيقات الأخرى.
تصف هذه الورقة تطور واستخدام الطفيليات التي تعبر عن pHluorin2 الموضعي جليكوسومي ، وهو مستشعر حيوي للبروتين يمكن توريثه. pHluorin2 هو متغير pHluorin نسبي يعرض انخفاضا يعتمد على الأس الهيدروجيني (الحمض) في الإثارة عند 395 نانومتر بينما ينتج عنه في نفس الوقت زيادة في الإثارة عند 475 نانومتر. تم إنشاء الطفيليات المعدلة وراثيا عن طريق استنساخ إطار القراءة المفتوح pHluorin2 في ناقل تعبير المثقبيات pLEW100v5 ، مما يتيح التعبير البروتيني المستحث في أي من مرحلتي دورة الحياة. تم استخدام التألق المناعي لتأكيد توطين الجليكوزوم للمستشعر الحيوي pHluorin2 ، ومقارنة توطين المستشعر الحيوي بالبروتين المقيم الجليكوزومي الألدولاز. تمت معايرة استجابة المستشعر عند مستويات مختلفة من الأس الهيدروجيني عن طريق احتضان الخلايا في سلسلة من المخازن المؤقتة التي تراوحت في الأس الهيدروجيني من 4 إلى 8 ، وهو نهج استخدمناه سابقا لمعايرة مستشعر الأس الهيدروجيني القائم على الفلوريسين. ثم قمنا بقياس مضان pHluorin2 عند 405 نانومتر و 488 نانومتر باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد الرقم الهيدروجيني للجليكوزوم. لقد تحققنا من أداء الطفيليات الحية المعدلة وراثيا التي تعبر عن pHluorin2 ، ومراقبة درجة الحموضة بمرور الوقت استجابة للحرمان من الجلوكوز ، وهو محفز معروف لتحمض الجليكوزومات في طفيليات PF. تحتوي هذه الأداة على مجموعة من التطبيقات المحتملة ، بما في ذلك إمكانية استخدامها في فحص الأدوية عالي الإنتاجية. بالإضافة إلى درجة الحموضة الجليكوزومية ، يمكن تكييف المستشعر مع عضيات أخرى أو استخدامه في المثقبيات الأخرى لفهم ديناميكيات الأس الهيدروجيني في إعداد الخلية الحية.
Introduction
تعتمد الأراستيدات الحركية الطفيلية ، مثل معظم الكائنات الحية ، على الجلوكوز كمكون أساسي في استقلاب الكربون المركزي. تشمل هذه المجموعة الكائنات الحية المهمة طبيا ، مثل المثقبيات الأفريقية ، المثقبية البروسي. المثقبيات الأمريكية ، T. cruzi ؛ والطفيليات من جنس الليشمانيا. استقلاب الجلوكوز أمر بالغ الأهمية لنمو الطفيليات في مراحل دورة الحياة المسببة للأمراض. على سبيل المثال ، عند الحرمان من الجلوكوز ، يموت شكل مجرى الدم (BSF) من المثقبيات الأفريقية بسرعة. والجدير بالذكر أن تحلل السكر يعمل كمصدر وحيد ل ATP خلال هذه المرحلة من العدوى1. تعتمد طفيليات الليشمانيا أيضا على الجلوكوز في المضيف البشري ، مع مرحلة دورة حياة amastigote الموجودة في الضامة المضيفة التي تعتمد على مصدر الكربون هذا للنمو2.
في حين أن هذه الطفيليات لها أنماط حياة متميزة تتضمن ناقلات حشرات مختلفة ، إلا أنها تشترك في العديد من القواسم المشتركة في كيفية استجابتها للجلوكوز واستهلاكه. على سبيل المثال ، تقوم هذه الطفيليات بتوطين معظم إنزيمات تحلل السكر في بيروكسيسومات معدلة تسمى الجليكوسومات. ترتبط هذه العضية الخاصة بالأرومة الحركية ببيروكسيسومات الثدييات بناء على آليات التخليق الحيوي المحفوظة والتشكل3،4،5،6.
يوفر تجزئة معظم إنزيمات مسار تحلل السكر في الجليكوسوم وسائل خاصة بالطفيليات لتنظيم المسار. باستخدام مسبار الأس الهيدروجيني الكيميائي ، أثبتنا أن الحرمان من المغذيات يؤدي إلى تحمض سريع لجليكوسومات طفيلية الشكل الحلقية (PF) التي تؤدي إلى تغيير نشاط إنزيم حال للسكر من خلال التعرض لموقع ربط منظم خيفي على إنزيم هيكسيوكيناز تحلل السكر الرئيسي 7,8. في عملنا السابق ، تطلب المسبار الكيميائي تسليما ثابتا للاستخدام ، مما حد من فائدته في التطبيقات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، حدت التحديات التي تم الحفاظ على توزيع المسبار في الجليكوسوم في BSF من فائدة النهج للتحقيق في درجة الحموضة الجليكوزومية في تلك المرحلة من الحياة.
في هذه الدراسة ، استخدمنا المستشعر الحيوي للبروتين الفلوري pHluorin2 لمراقبة تغير درجة الحموضة الجليكوزومية في BSF T. brucei استجابة للإشارات البيئية بما في ذلك تجويع الجلوكوز9 (الشكل 1). تشير نتائج هذا العمل إلى أن BSF T. brucei يحمض الجليكوسومات بسرعة استجابة للمجاعة بطريقة عكسية ، على غرار الاستجابات التي لاحظناها في طفيليات PF. نتوقع أن يحسن هذا المستشعر الحيوي فهمنا لتنظيم تحلل السكر في T. brucei والطفيليات ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن آليات الإدراك والاستجابة البيئية في المثقبيات الأفريقية غير مفهومة بشكل جيد. من المعروف أن التغييرات في توافر المغذيات تؤدي إلى استجابات متنوعة في الطفيلي ، بما في ذلك تحمض الجليكوزومات. لقد وصفنا هنا طريقة لدراسة استجابة الأس الهيدروجيني الجليكوزومي للاضطرابات البيئية في الخلايا ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم استنساخ pHluorin2-PTS1 إلى pLEW100v5 بواسطة Twist Bioscience الذي قدم البناء في ناقل استنساخ عالي النسخ. كان pLEW100v5 هدية من الدكتور جورج كروس. يتوفر المصل المضاد الذي أثير ضد T. brucei aldolase من الدكتورة ميريديث تي موريس ، جامعة كليمسون ، عند الطلب. تم دعم العمل من مختبرات JCM و KAC جزئيا بجائزة من المعاهد الوطنية للصحة (R01AI156382). تم دعم SSP بواسطة NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
- Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
- Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
- Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
- Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
- Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).
- Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- . Restriction digest v.2 Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018)
- . Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021)
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
- Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
- Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
- Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
- Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
- Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
- Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
- Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).
