Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi
Summary
PH’ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH’a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.
Abstract
Glikoz metabolizması, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei, temel bir metabolik süreç ve parazit gelişiminin düzenleyicisi olarak kritik öneme sahiptir. Çevresel glikoz seviyeleri değiştiğinde oluşan hücresel tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Hem kan dolaşımında hem de prosiklik formda (böcek evresi) parazitlerde, glikozomlar glikolizin çoğunu barındırır. Bu organeller, glikoz yoksunluğuna yanıt olarak hızla asitleştirilir, bu da muhtemelen hekzokinaz gibi glikolitik enzimlerin allosterik regülasyonuna neden olur. Önceki çalışmalarda, pH ölçümleri yapmak için kullanılan kimyasal probun lokalizasyonu zordu ve diğer uygulamalardaki kullanımını sınırlıyordu.
Bu makale, kalıtsal bir protein pH biyosensörü olan glikozomal olarak lokalize pHluorin2’yi eksprese eden parazitlerin gelişimini ve kullanımını açıklamaktadır. pHluorin2, 395 nm’de uyarmada pH’a (asit) bağlı bir azalma gösteren ve aynı anda 475 nm’de uyarmada bir artış sağlayan bir oransal pHluorin varyantıdır. Transgenik parazitler, pHluorin2 açık okuma çerçevesinin tripanozom ekspresyon vektörü pLEW100v5’e klonlanmasıyla üretildi ve her iki yaşam döngüsü aşamasında da indüklenebilir protein ekspresyonu sağlandı. pHluorin2 biyosensörünün glikozomal lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan kullanıldı ve biyosensörün lokalizasyonunu glikozomal yerleşik protein aldolaz ile karşılaştırdı. Sensörün yanıt verme hızı, daha önce floresein bazlı bir pH sensörünü kalibre etmek için kullandığımız bir yaklaşım olan pH değeri 4 ile 8 arasında değişen bir dizi tamponda hücrelerin inkübe edilmesiyle farklı pH seviyelerinde kalibre edildi. Daha sonra glikozomal pH’ı belirlemek için akış sitometrisi kullanarak 405 nm ve 488 nm’de pHluorin2 floresansını ölçtük. PF parazitlerinde bilinen bir glikozomal asitleşme tetikleyicisi olan glikoz yoksunluğuna yanıt olarak zaman içinde pH’ı izleyerek canlı transgenik pHluorin2 eksprese eden parazitlerin performansını doğruladık. Bu araç, potansiyel olarak yüksek verimli ilaç taramasında kullanılmak da dahil olmak üzere bir dizi potansiyel uygulamaya sahiptir. Sensör, glikozomal pH’ın ötesinde, canlı hücre ortamındaki pH dinamiklerini anlamak için diğer organellere uyarlanabilir veya diğer tripanosomatidlerde kullanılabilir.
Introduction
Parazitik kinetoplastidler, çoğu canlı organizma gibi, merkezi karbon metabolizmasının temel bir bileşeni olarak glikoza güvenir. Bu grup, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei gibi tıbbi açıdan önemli organizmaları içerir;Amerikan tripanozomu, T. cruzi; ve Leishmania cinsinin parazitleri. Glikoz metabolizması, patojenik yaşam döngüsü aşamalarında parazit büyümesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, glikozdan yoksun bırakıldığında, Afrika tripanozomunun kan dolaşımı formu (BSF) hızla ölür. Özellikle, glikoliz, enfeksiyonun bu aşamasında ATP’nin tek kaynağı olarak hizmet eder1. Leishmania parazitleri de aynı şekilde insan konakçıdaki glikoza bağımlıdır, konakçı makrofajlarda bulunan amastigot yaşam döngüsü aşaması büyüme için bu karbon kaynağına bağımlıdır2.
Bu parazitler, farklı böcek vektörlerini içeren farklı yaşam tarzlarına sahip olsalar da, glikoza nasıl tepki verdikleri ve tükettikleri konusunda birçok ortak noktayı paylaşırlar. Örneğin, bu parazitler çoğu glikolitik enzimi glikozom adı verilen modifiye peroksizomlara lokalize eder. Bu kinetoplastide spesifik organel, korunmuş biyosentetik mekanizmalara vemorfolojiye dayalı memeli peroksizomları ile ilişkilidir 3,4,5,6.
Glikolitik yol enzimlerinin çoğunun glikozoma bölümlendirilmesi, yolun düzenlenmesi için parazite özgü araçlar sunar. Kimyasal bir pH probu kullanarak, besin yoksunluğunun, anahtar glikolitik enzim hekzokinaz 7,8 üzerindeki bir allosterik düzenleyici bağlanma bölgesine maruz kalma yoluyla glikolitik enzim aktivitesinin değişmesine neden olan prosiklik form (PF) parazit glikozomlarının hızlı bir asitlenmesini tetiklediğini belirledik. Önceki çalışmamızda, kimyasal probun kullanım için sürekli teslimat gerektirmesi ve diğer uygulamalardaki faydasını sınırlaması gerekiyordu. Ek olarak, BSF’deki glikozomdaki prob dağılımını sürdürme zorlukları, bu yaşam evresinde glikozomal pH’ı araştırma yaklaşımının faydasını sınırladı.
Bu çalışmada, glikoz açlığı9 dahil olmak üzere çevresel ipuçlarına yanıt olarak BSF T. brucei’deki glikozomal pH değişimini izlemek için floresan protein biyosensörü pHluorin2’yi kullandık (Şekil 1). Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, BSF T. brucei’nin, PF parazitlerinde gözlemlediğimiz tepkilere benzer şekilde, açlığa yanıt olarak glikozomları geri dönüşümlü bir şekilde hızla asitleştirdiğini göstermektedir. Bu biyosensörün T. brucei ve ilgili parazitlerdeki glikolitik regülasyon anlayışımızı geliştireceğini umuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afrika tripanozomundaki çevresel algı ve tepki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Besin mevcudiyetindeki değişikliklerin, glikozomların asitlenmesi de dahil olmak üzere parazitte çeşitli tepkileri tetiklediği bilinmektedir. Burada, kalıtsal bir protein sensörü, pHluorin2 ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerdeki çevresel bozulmalara glikozomal pH tepkisini incelemek için bir yöntem tanımladık.
Sensörün kullanımında birkaç kritik adım vardır. İ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1, yapıyı yüksek kopyalı bir klonlama vektöründe sağlayan Twist Bioscience tarafından pLEW100v5’e klonlandı; pLEW100v5, Dr. George Cross’un hediyesiydi. T. brucei aldolase’ye karşı yetiştirilen antiserum, talep üzerine Clemson Üniversitesi’nden Dr. Meredith T. Morris’ten temin edilebilir. JCM ve KAC laboratuvarlarından yapılan çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (R01AI156382) bir ödülle kısmen desteklenmiştir. SSP, NIH 3R01AI156382 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
- Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
- Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
- Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
- Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
- Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).
- Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- . Restriction digest v.2 Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018)
- . Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021)
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
- Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
- Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
- Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
- Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
- Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
- Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
- Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).
