生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

グルコース代謝は、アフリカのトリパノソーマ( Trypanosoma brucei)にとって、寄生虫発生の必須代謝プロセスおよび調節因子として重要です。環境中のグルコースレベルが変化したときに生じる細胞応答については、ほとんど知られていません。血流寄生虫とプロサイクリック型(昆虫期)寄生虫の両方で、グリコソームは解糖の大部分を収容しています。これらの細胞小器官は、グルコース欠乏に応答して急速に酸性化され、その結果、ヘキソキナーゼなどの解糖酵素のアロステリック調節が起こる可能性があります。以前の研究では、pH測定に使用する化学プローブの局所化が困難であり、他のアプリケーションでの有用性が制限されていました。

この論文では、遺伝性タンパク質pHバイオセンサーであるグリコソーム局在性pHorin2を発現する寄生虫の開発と使用について説明します。pHluorin2 はレシオメトリック pH バリアントであり、395 nm で pH(酸)依存的な励起の低下を示すと同時に、475 nm での励起の増加を示します。トランスジェニック寄生虫は、pHluorin2オープンリーディングフレームをトリパノソーマ発現ベクターpLEW100v5にクローニングすることによって生成され、どちらのライフサイクルステージでも誘導可能なタンパク質発現を可能にしました。免疫蛍光法を用いて、pHluorin2バイオセンサーのグリコソーム局在を確認し、バイオセンサーの局在をグリコソーム常在タンパク質アルドラーゼと比較しました。センサーの応答性は、以前にフルオレセインベースのpHセンサーのキャリブレーションに使用したアプローチである、pH 4 から 8 の範囲の一連のバッファーで細胞をインキュベートすることにより、異なる pH レベルでキャリブレーションしました。次に、フローサイトメトリーを用いて405 nmおよび488 nmのpHluorin2蛍光を測定し、グリコソームのpHを測定しました。PF寄生虫のグリコソーム酸性化の引き金として知られているグルコース欠乏に反応してpHを経時的にモニタリングし、生きたトランスジェニックpHluorin2発現寄生虫の性能を検証しました。このツールは、ハイスループット薬物スクリーニングに使用される可能性など、さまざまな用途が考えられます。グリコソームのpHだけでなく、このセンサーを他のオルガネラに適合させたり、他のトリパノソーマチドに使用したりして、生細胞環境におけるpHダイナミクスを理解することができます。