Kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur als adjuvans ter bevordering van OVA-specifieke systemische en mucosale reacties
Summary
In dit protocol hebben we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (RA) ontwikkeld dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. Door de door de FDA goedgekeurde RA aan de nano-emulsie toe te voegen, werd antigeenspecifiek sIgA gepromoot in de vagina en dunne darm na intramusculaire injectie van de nano-emulsie.
Abstract
Kationische nanostructuren zijn naar voren gekomen als een adjuvans en antigeenafgiftesysteem dat de rijping van dendritische cellen, ROS-generatie en antigeenopname verbetert en vervolgens antigeenspecifieke immuunresponsen bevordert. In de afgelopen jaren heeft retinoïnezuur (RA) steeds meer aandacht gekregen vanwege het effect ervan bij het activeren van de mucosale immuunrespons; om RA echter als mucosale adjuvans te gebruiken, is het noodzakelijk om het probleem van het oplossen, laden en afleveren op te lossen. Hier beschrijven we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (CNE-RA) afgiftesysteem dat bestaat uit het kationische lipide 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOTAP), retinoïnezuur, squaleen als de oliefase, polysorbaat 80 als oppervlakteactieve stof en sorbitaantrioleaat 85 als co-oppervlakteactieve stof. De fysische en chemische eigenschappen werden gekarakteriseerd met behulp van dynamische lichtverstrooiing en een spectrofotometer. Immunisatie van muizen met het mengsel van antigeen (ovalbumine, OVA) en CNE-RA verhoogde significant de niveaus van anti-OVA secretoire immunoglobuline A (sIgA) in vaginale spoelvloeistof en de dunne darmspoelvloeistof van muizen in vergelijking met OVA alleen. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de voorbereiding, karakterisering en evaluatie van het adjuvante effect van CNE-RA.
Introduction
Adjuvantia worden vaak gebruikt om de werkzaamheid van een vaccin te verbeteren door het immuunsysteem te stimuleren om sterker op het vaccin te reageren, waardoor de immuniteit tegen een bepaalde ziekteverwekker wordtverhoogd. Nano-emulsie (NE) adjuvans verwijst naar een colloïdaal dispersiesysteem met thermodynamische stabiliteit door een bepaald deel van de oliefase en de waterige fase te emulgeren om een emulsie te produceren in de vorm van water-in-olie (W/O) of olie-in-water (O/W)2. O/W nano-emulsieadjuvans kan cytokines en chemokinen op de injectieplaats produceren, de snelle aggregatie en proliferatie van belangrijke immuuncellen zoals monocyten, neutrofielen en eosinofielen induceren, en de immuunrespons versterken en de immunogeniciteit van antigenen verbeteren3. Momenteel zijn drie nano-emulsieadjuvantia (MF59, AS03 en AF03) goedgekeurd voor gebruik in vaccins en hebben ze een goede veiligheid en werkzaamheid aangetoond4.
Mucosale immuniteit is echter slecht aangepakt door de momenteel goedgekeurde adjuvante formuleringen in conventionele parenterale vaccinatie5. Van retinoïnezuur (RA) is gemeld dat het intestinale homing van immuuncellen induceert, maar de lage polariteit, slechte oplosbaarheid in water en slechte licht- en thermische stabiliteit beperken het gebruik ervan voor robuuste darmvaccinatie. Nano-emulsies bieden mogelijkheden om de biologische beschikbaarheid van zeer lipofiele geneesmiddelen te verhogen, en de oliekern van O/W-emulsieadjuvantia is geschikt voor het oplossen van niet-polaire stoffen zoals RA6. Daarom kunnen nano-emulsies worden gebruikt als dragers voor RA om het dubbele responseffect van systemische immuniteit en mucosale immuniteit te bereiken.
Vergeleken met neutrale of anionische toedieningssystemen hebben kationische afgiftesystemen relatief efficiënte antigeeninkapseling en -afgiftemogelijkheden, wat de immunogeniciteit van antigenen kan verbeteren 7,8,9. De kationische oppervlaktelading van een verscheidenheid aan adjuvante systemen is belangrijk voor hun adjuvante effecten 10,11,12. De kationische lading is een belangrijke factor bij het verlengen van de retentie van het vaccin op de injectieplaats, het verhogen van de antigeenpresentatie en het verlengen van de stimulatie van de cellulaire immuniteit in het lichaam12.
Op basis van de bovenstaande overwegingen hebben we een kationische nano-emulsie ontwikkeld om RA en antigenen effectief samen af te leveren. De deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de nano-emulsie werden bepaald met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS), en de systemische en mucosale immuunresponsen van de nano-emulsie in combinatie met OVA werden geëvalueerd door intramusculaire injectie13.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol ontwikkelden we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. In vergelijking met traditionele NE-adjuvantia heeft het de volgende twee voordelen. Ten eerste heeft het oppervlak van O/W NE’s over het algemeen een hoge negatieve lading, waardoor het moeilijk is om antigenen direct te laden. Kationische NE’s kunnen peptide- of eiwitantigenen effectief adsorberen en de specifieke immunogenicite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door het Key Program van de Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) en het Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O’Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. Traversing the skin barrier with nano-emulsions. Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
