OVA'ya özgü sistemik ve mukozal yanıtları teşvik etmek için bir adjuvan olarak katyonik nanoemülsiyon kapsüllenmiş retinoik asit
Summary
Bu protokolde, antijene özgü sistemik ve mukozal yanıtları desteklemek için adjuvan olarak kullanılmak üzere katyonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit (RA) geliştirdik. FDA onaylı RA’yı nanoemülsiyona ekleyerek, nanoemülsiyonun intramüsküler enjeksiyonundan sonra vajina ve ince bağırsakta antijene özgü sIgA teşvik edildi.
Abstract
Katyonik nanoyapılar, dendritik hücre olgunlaşmasını, ROS oluşumunu ve antijen alımını artıran ve daha sonra antijene özgü immün yanıtları destekleyen bir adjuvan ve antijen dağıtım sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Son yıllarda, retinoik asit (RA), mukozal immün yanıtı aktive etmedeki etkisi nedeniyle artan bir ilgi görmüştür; bununla birlikte, RA’yı mukozal bir adjuvan olarak kullanmak için, çözünme, yüklenme ve verilme problemini çözmek gerekir. Burada, katyonik lipid 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOTAP), retinoik asit, yağ fazı olarak skualen, yüzey aktif madde olarak polisorbat 80 ve yardımcı yüzey aktif madde olarak sorbitan trioleat 85’ten oluşan katyonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit (CNE-RA) dağıtım sistemini tarif ediyoruz. Fiziksel ve kimyasal özellikleri, dinamik ışık saçılımı ve bir spektrofotometre kullanılarak karakterize edildi. Farelerin antijen (ovalbümin, OVA) ve CNE-RA karışımı ile aşılanması, vajinal lavaj sıvısında ve farelerin ince bağırsak lavaj sıvısında anti-OVA salgı immünoglobulin A (sIgA) seviyelerini tek başına OVA ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde yükseltti. Bu protokol, CNE-RA’nın adjuvan etkisinin hazırlanması, karakterizasyonu ve değerlendirilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar.
Introduction
Adjuvanlar genellikle bağışıklık sistemini aşıya daha güçlü yanıt vermesi için uyararak ve böylece belirli bir patojene karşı bağışıklığı artırarak bir aşının etkinliğini arttırmak için kullanılır1. Nanoemülsiyon (NE) adjuvanı, yağda su (W/O) veya suda yağ (O/W)2 şeklinde bir emülsiyon üretmek için belirli bir oranda yağ fazı ve sulu fazı emülsifiye ederek termodinamik stabiliteye sahip bir kolloidal dispersiyon sistemini ifade eder. O / W nanoemülsiyon adjuvanı, enjeksiyon bölgesinde sitokinler ve kemokinler üretebilir, monositler, nötrofiller ve eozinofiller gibi önemli bağışıklık hücrelerinin hızlı agregasyonunu ve proliferasyonunu indükleyebilir ve bağışıklık tepkisini artırabilir ve antijenlerin immünojenisitesini artırabilir3. Şu anda, üç nanoemülsiyon adjuvanı (MF59, AS03 ve AF03) aşılarda kullanım için lisanslanmıştır ve iyi güvenlik ve etkinlik göstermiştir4.
Bununla birlikte, mukozal bağışıklık, konvansiyonel parenteral aşılamada şu anda lisanslı adjuvan formülasyonlar tarafından yetersiz bir şekilde ele alınmıştır5. Retinoik asidin (RA) bağışıklık hücrelerinin bağırsak güdümünü indüklediği bildirilmiştir, ancak düşük polaritesi, suda zayıf çözünürlüğü ve zayıf ışık ve termal stabilitesi, sağlam enterik aşılama için kullanımını sınırlar. Nanoemülsiyonlar, yüksek derecede lipofilik ilaçların biyoyararlanımını arttırma fırsatları sunar ve O / W emülsiyon adjuvanlarının yağ çekirdeği, RA6 gibi polar olmayan maddelerin çözülmesi için uygundur. Bu nedenle, nanoemülsiyonlar, sistemik bağışıklık ve mukozal bağışıklığın ikili yanıt etkisini elde etmek için RA için taşıyıcı olarak kullanılabilir.
Nötr veya anyonik dağıtım sistemleriyle karşılaştırıldığında, katyonik dağıtım sistemleri, antijenlerin 7,8,9 immünojenisitesini artırabilen nispeten verimli antijen kapsülleme ve verme yeteneklerine sahiptir. Çeşitli adjuvan sistemlerin katyonik yüzey yükü, adjuvan etkileri için önemlidir 10,11,12. Katyonik yük, enjeksiyon bölgesinde aşı tutulma süresinin uzaması, antijen sunumunun arttırılması ve vücuttaki hücresel bağışıklığın uyarılmasının uzamasında önemli bir faktördür12.
Yukarıdaki hususlara dayanarak, RA ve antijenleri etkili bir şekilde birlikte iletmek için katyonik bir nanoemülsiyon geliştirdik. Nanoemülsiyonun partikül boyutu ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak belirlendi ve OVA ile kombine edilen nanoemülsiyonun sistemik ve mukozal immün yanıtları intramüsküler enjeksiyon13 ile değerlendirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, antijene özgü sistemik ve mukozal yanıtları teşvik etmek için adjuvan olarak kullanılmak üzere katyonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit geliştirdik. Geleneksel NE adjuvanları ile karşılaştırıldığında, aşağıdaki iki avantaja sahiptir. İlk olarak, genel olarak, O/W NE’lerin yüzeyi yüksek bir negatif yüke sahiptir, bu da antijenlerin doğrudan yüklenmesini zorlaştırır. Katyonik NE’ler, peptit veya protein antijenlerini etkili bir şekilde adsorbe edebilir ve spesifik immü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Anahtar Programı (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 32270988) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O’Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. Traversing the skin barrier with nano-emulsions. Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
