Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA
Summary
In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l’artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell’intestino tenue dopo l’iniezione intramuscolare della nanoemulsione.
Abstract
Le nanostrutture cationiche sono emerse come un adiuvante e un sistema di rilascio dell’antigene che migliora la maturazione delle cellule dendritiche, la generazione di ROS e l’assorbimento dell’antigene e quindi promuove risposte immunitarie antigene-specifiche. Negli ultimi anni, l’acido retinoico (RA) ha ricevuto una crescente attenzione per il suo effetto nell’attivare la risposta immunitaria della mucosa; tuttavia, per utilizzare l’artrite reumatoide come adiuvante della mucosa, è necessario risolvere il problema della sua dissoluzione, carico e consegna. Qui, descriviamo un sistema di rilascio di acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica (CNE-RA) composto dal lipide cationico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), acido retinoico, squalene come fase oleosa, polisorbato 80 come tensioattivo e trioleato di sorbitano 85 come co-tensioattivo. Le sue proprietà fisiche e chimiche sono state caratterizzate utilizzando la diffusione dinamica della luce e uno spettrofotometro. L’immunizzazione dei topi con la miscela di antigene (ovoalbumina, OVA) e CNE-RA ha aumentato significativamente i livelli di immunoglobulina A secretoria anti-OVA (sIgA) nel liquido di lavaggio vaginale e nel liquido di lavaggio dell’intestino tenue dei topi rispetto al solo OVA. Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione, la caratterizzazione e la valutazione dell’effetto adiuvante di CNE-RA.
Introduction
Gli adiuvanti sono spesso utilizzati per migliorare l’efficacia di un vaccino stimolando il sistema immunitario a rispondere più fortemente al vaccino, aumentando così l’immunità a un particolare agente patogeno1. L’adiuvante della nanoemulsione (NE) si riferisce a un sistema di dispersione colloidale con stabilità termodinamica emulsionando una certa proporzione di fase oleosa e fase acquosa per produrre un’emulsione sotto forma di acqua-in-olio (W/O) o olio-in-acqua (O/W)2. L’adiuvante di nanoemulsione O/W può produrre citochine e chemochine nel sito di iniezione, indurre la rapida aggregazione e proliferazione di importanti cellule immunitarie come monociti, neutrofili ed eosinofili, migliorare la risposta immunitaria e migliorare l’immunogenicità degli antigeni3. Attualmente, tre adiuvanti di nanoemulsione (MF59, AS03 e AF03) sono stati autorizzati per l’uso nei vaccini e hanno dimostrato una buona sicurezza ed efficacia4.
Tuttavia, l’immunità della mucosa è stata scarsamente affrontata dalle formulazioni adiuvanti attualmente autorizzate nella vaccinazione parenterale convenzionale5. È stato riportato che l’acido retinoico (RA) induce l’homing intestinale delle cellule immunitarie, ma la sua bassa polarità, la scarsa solubilità in acqua e la scarsa stabilità alla luce e termica ne limitano l’uso per una robusta vaccinazione enterica. Le nanoemulsioni offrono l’opportunità di aumentare la biodisponibilità di farmaci altamente lipofili e il nucleo oleoso degli adiuvanti per emulsioni O/W è adatto per sciogliere sostanze non polari come l’artrite reumatoide6. Pertanto, le nanoemulsioni possono essere utilizzate come vettori per l’artrite reumatoide al fine di ottenere il duplice effetto di risposta dell’immunità sistemica e dell’immunità della mucosa.
Rispetto ai sistemi di rilascio neutri o anionici, i sistemi di rilascio cationico hanno capacità di incapsulamento e rilascio dell’antigene relativamente efficienti, che possono migliorare l’immunogenicità degli antigeni 7,8,9. La carica cationica superficiale di una varietà di sistemi adiuvanti è importante per i loro effetti adiuvanti 10,11,12. La carica cationica è un fattore importante nel prolungare la ritenzione del vaccino nel sito di iniezione, aumentando la presentazione dell’antigene e prolungando la stimolazione dell’immunità cellulare nel corpo12.
Sulla base delle considerazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato una nanoemulsione cationica per co-fornire efficacemente AR e antigeni. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta della nanoemulsione sono stati determinati utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) e le risposte immunitarie sistemiche e mucose della nanoemulsione combinata con OVA sono state valutate mediante iniezione intramuscolare13.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Rispetto ai tradizionali adiuvanti NE, presenta i seguenti due vantaggi. In primo luogo, in generale, la superficie degli O/W EN ha un’elevata carica negativa, che rende difficile caricare direttamente gli antigeni. Le EN cationiche possono adsorbire efficacemente antigeni peptidici o proteici e migliorare l’immunogenicità specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dal programma chiave della Fondazione per le scienze naturali di Chongqing (n. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e dal progetto della Fondazione nazionale cinese per le scienze naturali (n. 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
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