تصنيع شبكة التقارب العقدي لإعداد عينة المجهر الإلكتروني بالتبريد
Summary
يتم توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتصنيع شبكات تقارب الستربتافيدين لاستخدامها في الدراسات الهيكلية لعينات الجزيئات الكبيرة الصعبة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد.
Abstract
توفر شبكات تقارب الستربتافيدين استراتيجيات للتغلب على العديد من تحديات تحضير العينات بالمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) الشائعة ، بما في ذلك تمسخ العينة والتوجهات التفضيلية التي يمكن أن تحدث بسبب واجهة الهواء والماء. ومع ذلك ، يتم استخدام شبكات تقارب الستربتافيدين حاليا من قبل عدد قليل من مختبرات cryo-EM لأنها غير متوفرة تجاريا وتتطلب عملية تصنيع دقيقة. تزرع بلورات الستربتافيدين ثنائية الأبعاد على طبقة أحادية من الدهون البيوتينيلية يتم تطبيقها مباشرة على شبكات cryo-EM القياسية ذات الكربون الهولي. يسمح التفاعل عالي التقارب بين الستربتافيدين والبيوتين بالربط اللاحق للعينات البيوتينيلاتية المحمية من واجهة الهواء والماء أثناء تحضير عينة cryo-EM. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه الشبكات استراتيجية لتركيز العينات المتاحة بكميات محدودة وتنقية مجمعات البروتين ذات الأهمية مباشرة على الشبكات. هنا ، يتم توفير بروتوكول محسن خطوة بخطوة للتصنيع القوي لشبكات تقارب الستربتافيدين لاستخدامها في تجارب cryo-EM والبقع السلبية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تضمين دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها للتحديات الشائعة لجعل استخدام شبكات تقارب الستربتافيدين أكثر سهولة لمجتمع cryo-EM الأكبر.
Introduction
أحدث المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) ثورة في مجال البيولوجيا الهيكلية من خلال تمكين تحديد البنية الجزيئية الكبيرة والمرنة وغير المتجانسة التي لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي النووي1. تعمل هذه الطريقة عن طريق تجميد الجزيئات الكبيرة في محلول لإنشاء طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي يمكن تصويرها لاحقا باستخدام المجهر الإلكتروني. في السنوات الأخيرة ، أدت التطورات الكبيرة في كل من أجهزة المجهر وبرامج معالجة الصور إلى توسيع أنواع العينات المناسبة لتحديد الهيكل عالي الدقة بواسطة cryo-EM.
ومع ذلك ، يظل تحضير العينات الرقيقة والمزججة أحد أهم الخطوات في تحديد التركيب الجزيئي الكبير بواسطة cryo-EM. غالبا ما تكون العينات البيولوجية ديناميكية وهشة وعرضة للتمسخ ، وأحيانا لا تتوفر إلا بكميات صغيرة لدراسات cryo-EM. أثناء عملية النشاف ، تتفاعل هذه الجسيمات مع واجهة الهواء والماء الكارهة للماء ، والتي يمكن أن تؤدي إلى اتجاهات مفضلة للجسيمات ، وتفكيك المعقدات الهشة ، وتمسخ العينة الجزئي أو الكامل ، والتجميع2،3،4. يعد استخدام المنظفات أو المواد الخافضة للتوتر السطحي الأخرى ، والربط المتقاطع الكيميائي ، وامتصاص العينات لدعم الطبقات من الاستراتيجيات الشائعة للحفاظ على العينات البيولوجية أثناء عملية التجميد. تعمل طبقات الدعم مثل أكسيد الجرافين5،6،7 أو الكربون غير المتبلور8 أيضا على تركيز الجسيمات على الشبكة عن طريق الامتزاز عندما تكون العينة متاحة بكميات محدودة. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست عامة أو موثوقة ، ويمكن أن يستغرق تحسين إعداد الشبكة وقتا طويلا للغاية أو يفشل تماما.
تم تطوير شبكات تقارب Streptavidin 9,10 للتغلب على أوجه القصور هذه ولتوفير طريقة معتدلة وقابلة للتطبيق بشكل عام لعزل مجمع الاهتمام وحمايته من واجهة الهواء والماء. تستخدم هذه الشبكات شبكة بلورية ثنائية الأبعاد (2D) من الستربتافيدين تزرع على طبقة أحادية من الدهون البيوتينيلاتية على الشبكة. بعد أن يتم تكوين البيوتينيل في العينات نفسها (غالبا ما تكون قليلة وعشوائية ، مما يعني وجود بيوتين واحد لكل مركب في المتوسط) ، يمكن تطبيقها على الشبكة المغلفة بالستربتافيدين . نظرا لأن امتزاز العينة يعتمد على التقارب العالي للغاية بين الستربتافيدين والبيوتين ، يمكن استخدام تركيزات عينة منخفضة تصل إلى 10 نانومتر مع هذه الشبكات. مجموعات البيوتينيل المتاحة تجاريا للبروتينات وبادئات البيوتينيل للمجمعات المحتوية على الحمض النووي تجعل من السهل نسبيا إرفاق أجزاء البيوتين الضرورية بمعظم العينات ذات الأهمية. بالإضافة إلى تركيز العينة وإبقائها بعيدا عن واجهة الهواء والماء الضارة أثناء النشاف ، يمكن أن يؤدي البيوتينيل العشوائي لواحد أو عدد قليل من بقايا اللايسين إلى تحسين نطاق اتجاهات الجزيء محل الاهتمام على شبكة cryo-EM بشكل كبير ، كما هو موضح في عدد من الدراسات11. في حين أن الإشارة من بلورة الستربتافيدين الأساسية موجودة في الصور الخام ، يمكن إزالة مخططات معالجة البيانات التي تتضمن ترشيح فورييه لانعكاسات براغ الحادة من البلورة بسهولة أثناء معالجة البيانات المبكرة ، مما يتيح في النهاية إعادة بناء عالية الدقة للعينة محل الاهتمام11،12،13. هنا ، يتم توفير بروتوكول محسن خطوة بخطوة للإنتاج القوي لشبكات تقارب الستربتافيدين والاستخدام اللاحق في تجارب cryo-EM. من المتوقع أن يكتمل البروتوكول المقدم خلال فترة أسبوعين (الشكل 1أ). تصف الأجزاء الأولى من البروتوكول تحضير الكواشف ، والمعالجة المسبقة للشبكات ، وخطوات تبخر الكربون الأولى. بعد ذلك ، يتم وصف التعليمات لإعداد الطبقة الأحادية الدهنية ونمو بلورات الستربتافيدين على شبكات EM. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تعليمات لاستخدام شبكات تقارب الستربتافيدين في تجارب EM و cryo-EM للبقع السلبية. أخيرا ، يتم توفير إجراءات لإزالة إشارة الستربتافيدين من الصور المجهرية بمجرد الحصول على بيانات cryo-EM.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف بروتوكولنا كيفية صنع واستخدام شبكات تقارب الستربتافيدين وكيفية معالجة البيانات التي تحتوي على إشارة حيود الستربتافيدين. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا.
يمكن إرجاع دفعات الشبكة غير الناجحة إلى العديد من الأخطاء الشائعة. المصدر الأكثر شيوعا للخطأ يأتي من استخدام الكواشف القديمة أو ذات الجودة الرديئة. من المهم بشكل خاص تحضير محلول الدهون البيوتينيلية تماما كما هو موضح في البروتوكول. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤثر أي شوائب ، مثل بقايا المنظفات على أدوات المختبر أو الزيوت الموجودة بشكل طبيعي على الجلد ، على جودة بلورات الستربتافيدين ، وبالتالي جودة الصور الناتجة. لذلك يوصى بإجراء ثلاث دورات غسيل للشبكات قبل تبخر الكربون الأول لإزالة التلوث المحتمل بالسطح من الشركة المصنعة للشبكة (الخطوة 2.1). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تلوث أو شوائب زيت الخروع لإعاقة تكوين البلورات على الشبكة.
يعد صنع الطبقة الأحادية الدهنية والتقاطها مهمة يجب ممارستها عدة مرات للتعرف على أحجام الدهون الصغيرة. ليس من غير المعتاد أن تفشل هذه الخطوة في أول مرتين أو ثلاث مرات قبل أن يتم إنتاج طبقة أحادية دهنية كافية ، كما ينعكس في النهاية في جودة بلورات الستربتافيدين التي تظهر في شبكات ملطخة سلبا (الشكل 4C).
من المهم ألا تدع الجانب الخلفي (الجانب الذهبي ، الجانب الدهني) من الشبكة يبلل أثناء عملية تصنيع الشبكة (الخطوات 3.12-3.20). في حالة تبلل المؤخر ، يوصى بتجاهل الشبكة. يمكن أن يؤدي ذلك إلى ظهور حويصلات دهنية كبيرة تعطل جودة الصورة (الشكل 5D) (الصف 3 ، الجدول 1). يمكن أيضا ملاحظة الحويصلات الدهنية بسبب عدم كفاية الغسيل بعد تطبيق الطبقة الأحادية الدهنية (الخطوة 3.13). يوصى بثلاث غسلات لاحقة باستخدام محلول التبلور بعد لمس الطبقة الأحادية الدهنية قبل إضافة الستربتافيدين.
بعد تبخير طبقة رقيقة من الكربون على شبكات مدمجة في الترهالوز ، يمكن أن يكون الجانب الخلفي من الشبكة رطبا دون الإضرار بجودة الشبكة. على سبيل المثال ، يتم ملاحظة ترطيب المؤخر بشكل متكرر عندما يحتوي المخزن المؤقت للعينة على كميات قليلة من المنظفات. يمكن أن يؤدي ترطيب المؤخرة بواسطة العينة إلى ارتباط غير محدد للعينات بطبقة الكربون الرقيقة على الجانب الخلفي ، مما يقلل من فعالية منع الجسيمات من الانتشار إلى واجهة الهواء والماء أو استخدام ربط التقارب لاستراتيجيات التنقية على الشبكة. إذا أمكن ، أضف العينة إلى الشبكة في حالة عدم وجود منظف. يمكن إضافة المنظفات والمواد المضافة الأخرى لاحقا أثناء خطوات غسل الشبكة أو إضافتها في خطوة أخيرة قبل التزجيج. هذا هو أحد القيود على استخدام شبكات تقارب الستربتافيدين ؛ ومع ذلك ، إذا كان الهدف هو تحسين التوجه التفضيلي ، فقد تم إجراء تحضير العينة باستخدام المخازن المؤقتة ، بما في ذلك المنظفات ، بنجاح11.
يمكن تتبع مصدر الخطأ الشائع إلى عمر الشبكات بالنسبة إلى كل من خطوات تبخر الكربون (الخطوة 2.3 والخطوة 3.21). في هذا البروتوكول ، تكون فترة الانتظار الموصى بها هي 5-7 أيام بعد تبخر الكربون الخلفي قبل استخدام شبكات الستربتافيدين ل cryo-EM. عندما يتم استخدام الشبكات في وقت مبكر جدا بعد التصنيع ، لوحظ أن الطبقة الأحادية الشبكية والدهون تحشد خارج ثقوب الشبكة. يمكن إجراء ملاحظة مماثلة عندما تكون الشبكات قديمة جدا وتستخدم بعد ستة أشهر (الشكل 5 أ) (الصف 1 ، الجدول 1). نفترض أن هذه الملاحظة تفسر بالتغيرات في الكارهة للماء لدعامة الكربون التي يتم تطبيقها لتثبيت بلورات الدهون أحادية الطبقة والستربتافيدين. بالإضافة إلى ذلك ، قد تظهر شبكات الستربتافيدين فسيفساء (الشكل 5 ب) (الصف 3 ، الجدول 1) ومكسورة في كل من البقع السالبة و cryo-EM إذا تم تطبيق الطبقة الأحادية على الشبكات حيث لم تتقدم طبقة تبخر الكربون الأولى (الخطوة 2.3) بما فيه الكفاية.
يمكن إرجاع مصدر شائع إضافي للخطأ إلى هشاشة الطبقة الأحادية البلورية للستربتافيدين (الطبقة الأحادية الدهنية هي نفسها سائلة ويمكن أن تتوسع أو تضغط بشكل عكسي). يوفر تبخر الكربون الخلفي (الخطوة 3.21) ثباتا حرجا لكل من الشبكة أحادية الطبقة والستربتافيدين أثناء عملية امتصاص العينة والغسيل ونشاف cryo-EM. في حالة عدم وجود تبخر كاف للكربون إلى الجانب الخلفي من الشبكة ، غالبا ما تظهر شبكات الستربتافيدين مجزأة بعد النشاف / التجميد (الشكل 5C) (الصف 2 ، الجدول 1). في هذا البروتوكول ، نقترح استخدام فريزر غطس أوتوماتيكي من جانب واحد للنشاف من جانب واحد. تنتج هذه الطريقة ظروف نشاف قابلة للتكرار بدرجة عالية تحافظ على شبكة الستربتافيدين أثناء عملية التجميد وتسمح بالتحسين المبسط لتطبيق العينة ومعلمات النشاف. بدلا من ذلك ، تم استخدام أجهزة التجميد الآلي الأخرى مع النشاف اليدوي. للقيام بذلك ، يتم تعطيل وظيفة النشاف الفعلية في إعدادات الجهاز ، ويتم مسح الشبكة بدلا من ذلك عن طريق الوصول إلى زوج من الملقط يحمل الورق النشاف من خلال المدخل الجانبي. يمكن أن تحقق هذه الطريقة نتائج عالية الجودة للمختبرات بدون جهاز نشاف وتجميد من جانب واحد ؛ ومع ذلك ، فإن قابلية التكاثر من شبكة إلى شبكة تمثل تحديا.
في حين أن استخدام شبكات تقارب الستربتافيدين له العديد من المزايا ، يجب مراعاة بعض قيود هذه الطريقة. نظرا لطبيعة الإجراء ، لا يمكن عادة تقييم جودة شبكة الستربتافيدين حتى تكتمل العملية بأكملها. يقترح فحص جودة كل دفعة بسرعة عن طريق البقعة السلبية قبل تجميد العينات. نظرا للإشارة التي تساهم بها شبكة الستربتافيدين في الصور الخام ، قد يكون من الصعب في بعض الحالات تقييم ، من الصور وحدها ، ما إذا كان هناك عدد كاف من الجسيمات السليمة والمشتتة. للسبب نفسه ، لا يمكن معالجة بيانات cryo-EM أثناء الحصول على البيانات أثناء الحصول على البيانات ما لم يتم تضمين إجراء طرح إشارة الستربتافيدين في خط أنابيب المعالجة المسبقة للبيانات. نظرا لأن إشارة الستربتافيدين عادة ما يتم طرحها من الصور المصححة للحركة وليس الإطارات نفسها ، فقد يفشل تلميع Bayesian ، كما هو مطبق في مجموعات البرامج الشائعة ، عند استخدام إجراءات الطرح كما هو موضح. لذلك يوصى بإجراء تصحيح الحركة في بقع متعددة لتقليل حركة الجسيمات من بداية معالجة البيانات16.
على الرغم من هذه القيود ، توفر شبكات تقارب الستربتافيدين العديد من المزايا. هناك ميزتان رئيسيتان توفرهما شبكات تقارب الستربتافيدين على شبكات cryo-EM القياسية ذات الفتحة المفتوحة وهما وسيلة لحماية العينات من واجهة الهواء والماء وتركيز العينات ذات الوفرة المنخفضة (10-100 نانومتر) على الشبكة. يمكن أيضا استخدام طبقات الدعم الأخرى ، مثل أكسيد الكربون والجرافين ، كاستراتيجيات للتغلب على اختناقات تحضير العينات. في أحد الأمثلة ، كانت شبكات تقارب الستربتافيدين هي الحل الوحيد للحصول على إعادة بناء سليمة لتفاعل البروتين والحمض النووي الذي كان غير متوافق مع نهج الربط المتقاطع. 12
ميزة رئيسية أخرى توفرها شبكات تقارب الستربتافيدين هي حل للعينات التي تمتز لطبقات الدعم الأخرى ، مثل أكسيد الكربون أو الجرافين ، مع الاتجاهات المفضلة التي تعيق القدرة على الحصول على إعادة بناء 3D للعينة ذات الاهتمام. يسمح البيوتينيل العشوائي للعينات باستخدام مجموعات متاحة تجاريا بالتعلق العشوائي للعينة ذات الأهمية بطبقة الستربتافيدين الأحادية للحصول على المزيد من المشاهدات المحتملة للتغلب على هذا التحدي.
بالإضافة إلى ذلك ، توفر شبكات تقارب الستربتافيدين مزايا فريدة للشبكات القائمة على التقارب. يسمح التقارب العالي وخصوصية تفاعل الستربتافيدين والبيوتين باقتران شبكات تقارب الستربتافيدين مع تدفقات العمل الأخرى التي تتضمن البيوتين لتنقية المجمعات ذات الأهمية. في أحد الأمثلة المنشورة ، قام المؤلفون بشل حركة مجمع على شبكات تقارب الستربتافيدين واحتضان شريكا ملزما للقياس المتكافئ غير المعروف بفائض كبير. بعد غسل أي بروتين غير منضم ، تم الحصول على المركب الفائق الذي تم تجميعه بشكل صحيح ويمكن تحليله على الفور باستخدام cryo-EM11. قد يكون أحد التطبيقات المستقبلية المحتملة هو الجمع بين علامات البروتين المرتبطة بالستربتافيدين ، أو نظام Avi-tag ، أو نهج وضع العلامات القريبة مع شبكات تقارب الستربتافيدين لاستخراج البروتينات المفردة و / أو مجمعات البروتين مباشرة من المصادر المؤتلفة أو الداخلية دون مخططات تنقية قياسية مفصلة.
من خلال توفير هذا البروتوكول ، يجب أن تكون المختبرات قادرة على إعادة إنتاج تصنيع شبكات تقارب الستربتافيدين بسهولة وتأسيسها كأداة أكثر استخداما للتحليل الهيكلي لمجمعات البروتين بواسطة cryo-EM.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم T.C. من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة منحة التدريب على الفيزياء الحيوية الجزيئية GM-08295 وزمالة أبحاث الدراسات العليا لمؤسسة العلوم الوطنية بموجب رقم المنحة DGE 2146752. تم دعم R.G. و B.H. من خلال منحة المعهد الوطني للصحة R21-GM135666 الممنوحة ل R.G. و B.H. تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منحة المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R35-GM127018 الممنوحة ل E.N. E.N. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. . Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -. G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -. G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
