Изготовление стрептавидин-аффинной сетки для пробоподготовки методом криоэлектронной микроскопии
Summary
Представлен пошаговый протокол изготовления аффинных сеток стрептавидина для использования в структурных исследованиях сложных образцов макромолекул методом криоэлектронной микроскопии.
Abstract
Аффинные сетки стрептавидина обеспечивают стратегии для преодоления многих часто встречающихся проблем подготовки образцов при криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), включая денатурацию образца и преимущественную ориентацию, которая может возникнуть из-за границы раздела воздух-вода. Однако сродные решетки стрептавидина в настоящее время используются несколькими крио-ЭМ лабораториями, поскольку они не являются коммерчески доступными и требуют тщательного процесса изготовления. Двумерные кристаллы стрептавидина выращивают на биотинилированном липидном монослое, который наносится непосредственно на стандартные дырявые углеродные крио-ЭМ сетки. Высокоаффинное взаимодействие между стрептавидином и биотином позволяет осуществлять последующее связывание биотинилированных образцов, защищенных от границы раздела воздух-вода, во время крио-ЭМ пробоподготовки. Кроме того, эти сетки обеспечивают стратегию концентрирования образцов, доступных в ограниченных количествах, и очистки интересующих белковых комплексов непосредственно на сетках. Здесь представлен пошаговый, оптимизированный протокол для надежного изготовления аффинных решеток стрептавидина для использования в крио-ЭМ и экспериментах с отрицательным окрашиванием. Кроме того, в комплект поставки включено руководство по устранению неполадок для решения часто возникающих проблем, чтобы сделать использование аффинити-решеток стрептавидина более доступным для более широкого сообщества крио-ЭМ.
Introduction
Электронная криомикроскопия (крио-ЭМ) произвела революцию в области структурной биологии, позволив определять макромолекулярную структуру больших, гибких и гетерогенных образцов, которые ранее были недоступны с помощью рентгеновской кристаллографии или ядерногомагнитного резонанса. Этот метод заключается в мгновенном замораживании макромолекул в растворе для создания тонкого слоя стекловидного льда, который впоследствии можно визуализировать с помощью электронного микроскопа. В последние годы значительные достижения как в аппаратном обеспечении микроскопа, так и в программном обеспечении для обработки изображений еще больше расширили типы образцов, пригодных для определения структуры с высоким разрешением с помощью крио-ЭМ.
Тем не менее, подготовка тонких витрифицированных образцов остается одним из наиболее важных этапов определения структуры макромолекул с помощью крио-ЭМ. Биологические образцы часто динамичны, хрупки, склонны к денатурации, а иногда доступны только в небольших количествах для крио-ЭМ исследований. В процессе блоттинга эти частицы взаимодействуют с гидрофобной границей раздела воздух-вода, что может привести к предпочтительной ориентации частиц, разборке хрупких комплексов, частичной или полной денатурации образца и агрегации 2,3,4. Использование детергентов или других поверхностно-активных веществ, химическая сшивка и адсорбция образцов для поддержки слоев являются распространенными стратегиями сохранения биологических образцов в процессе замораживания. Поддерживающие слои, такие как оксид графена 5,6,7 или аморфный углерод8, также служат для концентрации частиц в сетке путем адсорбции, когда образец доступен в ограниченных количествах. Однако эти методы не являются универсальными или надежными, а оптимизация подготовки сетки может быть чрезвычайно трудоемкой или вообще потерпеть неудачу.
Для преодоления этих недостатков и обеспечения мягкого и общеприменимого метода секвестрации интересующего комплекса и защиты его от границы раздела воздух-вода были разработаны аффинные сетки стрептавидина 9,10. В этих сетках используется двумерная (2D) кристаллическая решетка стрептавидина, выращенная на монослое биотинилированных липидов на сетке. После того, как сами образцы будут биотинилированы (часто редко и случайным образом, то есть в среднем по одному биотину на комплекс), их можно наносить на сетку, покрытую стрептавидином. Поскольку адсорбция образца зависит от чрезвычайно высокого сродства между стрептавидином и биотином, с этими сетками можно использовать концентрацию образца до 10 нМ. Коммерчески доступные наборы для биотинилирования белков и биотинилированные праймеры для ДНК-содержащих комплексов позволяют относительно легко прикреплять необходимые фрагменты биотина к большинству интересующих образцов. В дополнение к концентрированию образца и удержанию его подальше от повреждающей границы раздела воздух-вода во время блоттинга, случайное биотинилирование одного или нескольких остатков лизина может значительно улучшить диапазон ориентаций интересующей молекулы на крио-ЭМ сетке, как показано в ряде исследований11. Несмотря на то, что сигнал от лежащего в основе кристалла стрептавидина присутствует в необработанных изображениях, схемы обработки данных, включающие фурье-фильтрацию резких брэгговских отражений от кристалла, могут быть легко удалены во время ранней обработки данных, что в конечном итоге позволяет реконструировать интересующий образец с высоким разрешением 11,12,13. Здесь предусмотрен оптимизированный пошаговый протокол для надежного получения аффинных решеток стрептавидина и последующего использования в крио-ЭМ экспериментах. Ожидается, что представленный протокол будет завершен в течение 2 недель (рисунок 1А). В первых частях протокола описывается приготовление реагентов, предварительная обработка решеток и первые этапы испарения углерода. Далее описана инструкция по приготовлению липидного монослоя и выращиванию кристаллов стрептавидина на ЭМ-сетках. Кроме того, приведены инструкции по использованию аффинных сеток стрептавидина в экспериментах с отрицательным окрашиванием ЭМ и крио-ЭМ. Наконец, предусмотрены процедуры удаления сигнала стрептавидина с микрофотографий после получения данных крио-ЭМ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш протокол описывает, как создавать и использовать аффинные сетки стрептавидина и как обрабатывать данные, содержащие дифракционный сигнал стрептавидина. В протоколе есть несколько важных шагов, которые требуют особого внимания.
Неудачные пакеты сетки могут быть связаны с несколькими распространенными ошибками. Наиболее распространенным источником ошибок является использование устаревших или некачественных реагентов. Особенно важно приготовить раствор биотинилированных липидов в точности так, как описано в протоколе. Кроме того, любые примеси, такие как остатки моющего средства на лабораторной посуде или натуральные масла на коже, могут повлиять на качество кристаллов стрептавидина и, следовательно, на качество получаемых изображений. Поэтому рекомендуется выполнить три цикла промывки решеток перед первым испарением углерода, чтобы удалить возможное загрязнение поверхностно-активными веществами от производителя сети (шаг 2.1). Кроме того, было замечено, что загрязнение или примесь касторового масла препятствуют образованию кристаллов на сетке.
Создание и захват липидного монослоя – это задача, которую следует попрактиковать несколько раз, чтобы почувствовать небольшие объемы липидов. Нет ничего необычного в том, что этот этап терпит неудачу в первые два-три раза, прежде чем может быть получен адекватный липидный монослой, что в конечном итоге отражается на качестве кристаллов стрептавидина, которые видны в отрицательно окрашенных сетках (рис.
Важно ни в коем случае не допускать намокания тыльной стороны сетки (золотой стороны, липидной стороны) в процессе изготовления сетки (шаги 3.12-3.20). В случае, если тыльная сторона все-таки намокнет, рекомендуется отказаться от сетки. Это может привести к появлению крупных липидных везикул, которые нарушают качество изображения (рис. 5D) (строка 3, таблица 1). Липидные везикулы также могут наблюдаться из-за недостаточной промывки после нанесения липидного монослоя (шаг 3.13). Рекомендуется провести три последующие промывки с использованием кристаллизационного буфера после прикосновения к липидному монослою перед добавлением стрептавидина.
После того, как тонкий слой углерода был испарен на решетках, внедренных трегалозой, тыльная сторона решетки может быть влажной, не повреждая качество решетки. Например, часто наблюдается намокание тыльной стороны, когда буфер образца содержит даже минимальное количество моющего средства. Смачивание обратной стороны образцом может привести к неспецифическому связыванию образцов с тонкой углеродной пленкой на обратной стороне, что снижает эффективность предотвращения диффузии частиц на границу раздела воздух-вода или использования аффинного связывания для стратегий очистки в сетке. Если есть возможность, добавьте пробу в сетку при отсутствии моющего средства. Моющее средство и другие добавки могут быть добавлены впоследствии на этапах промывки сетки или добавлены на заключительном этапе перед стекловидованием. Это одно из ограничений для использования аффинных решеток стрептавидина; Однако, если цель состоит в том, чтобы улучшить преимущественную ориентацию, подготовка проб с использованием буферов, включая моющее средство, была успешно проведена11.
Общий источник ошибок может быть прослежен до возраста решеток относительно обеих стадий испарения углерода (шаг 2.3 и шаг 3.21). В этом протоколе рекомендуемый период ожидания составляет 5-7 дней после испарения углерода с обратной стороны перед использованием стрептавидиновых сеток для крио-ЭМ. Когда сетки используются слишком рано после изготовления, было замечено, что решетка и липидный монослой мобилизуются из отверстий сетки. Аналогичное наблюдение может быть сделано, когда сетки слишком стары и используются через шесть месяцев (рис. 5А) (строка 1, таблица 1). Мы предполагаем, что это наблюдение объясняется изменениями гидрофобности углеродной основы, применяемой для стабилизации липидного монослоя и кристаллов стрептавидина. Кроме того, решетки стрептавидина могут выглядеть мозаичными (рис. 5Б) (ряд 3, таблица 1) и нарушаться как в отрицательном окрашивании, так и в крио-ЭМ, если монослой наносится на решетки, где первый слой испарения углерода (шаг 2.3) недостаточно состарился.
Еще одним распространенным источником ошибок может быть хрупкость кристаллического монослоя стрептавидина (липидный монослой сам по себе является жидким и может обратимо расширяться или сжиматься). Обратное испарение углерода (этап 3.21) обеспечивает критическую стабильность как монослоя, так и решетки стрептавидина во время процесса адсорбции образца, промывки и крио-ЭМ-блоттинга. При отсутствии достаточного испарения углерода на обратной стороне сетки решетки стрептавидина часто будут выглядеть фрагментированными после промокания/замораживания (Рисунок 5C) (Строка 2, Таблица 1). В этом протоколе мы предлагаем использовать одностороннюю автоматизированную погружную морозильную камеру для одностороннего промокания. Этот метод позволяет получить высоковоспроизводимые условия блоттинга, которые сохраняют решетку стрептавидина в процессе замораживания и позволяют оптимизировать применение образца и параметры блоттинга. В качестве альтернативы используются другие автоматические аппараты для погружной заморозки в сочетании с ручным промоканием. Для этого в настройках устройства отключается собственно функция промокательной бумаги, а вместо нее промокается сетка, протягивая пинцетом промокательную бумагу через боковой вход. Этот метод позволяет достичь высококачественных результатов для лабораторий без одностороннего промокательного и погружного морозильного устройства; Тем не менее, воспроизводимость между сетками является сложной задачей.
Несмотря на то, что использование аффинити-сеток стрептавидина имеет много преимуществ, необходимо учитывать некоторые ограничения этого метода. Из-за характера процедуры обычно невозможно оценить качество решетки стрептавидина до тех пор, пока не будет завершен весь процесс. Перед замораживанием образцов рекомендуется быстро проверять качество каждой партии негативным окрашиванием. Из-за сигнала, вносимого решеткой стрептавидина в необработанные изображения, в некоторых случаях может быть сложно оценить, достаточно ли неповрежденных, дисперсных частиц на основе одних только изображений. По этой же причине обработка крио-ЭМ данных «на лету» во время сбора данных невозможна, если в конвейер предварительной обработки данных не включена процедура вычитания сигнала стрептавидина. Поскольку сигнал стрептавидина обычно вычитается из изображений с коррекцией движения, а не из самих кадров, байесовская полировка, реализованная в популярных программных пакетах, может завершиться ошибкой при использовании описанных процедур вычитания. Поэтому рекомендуется выполнять коррекцию движения в нескольких участках, чтобы свести к минимуму движение частиц с самого начала обработки данных16.
Несмотря на эти ограничения, аффинные сетки стрептавидина обладают многими преимуществами. Два основных преимущества, которые обеспечивают сродственные сетки стрептавидина по сравнению со стандартными крио-ЭМ сетками с открытым отверстием, заключаются в том, что они защищают образцы от границы раздела воздух-вода и концентрируют образцы с низким содержанием (10-100 нМ) на сетке. Другие вспомогательные слои, такие как оксид углерода и графена, также могут использоваться в качестве стратегий для преодоления этих узких мест при подготовке проб. В одном из примеров аффинные решетки стрептавидина были единственным решением для получения неповрежденной реконструкции взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой, которая была несовместима с подходами сшивания. 12 См.
Еще одним важным преимуществом, которое обеспечивают аффинные решетки стрептавидина, является решение для образцов, которые адсорбируются на других поддерживающих слоях, таких как оксид углерода или графена, с предпочтительной ориентацией, которая препятствует возможности получения 3D-реконструкции интересующего образца. Случайное биотинилирование образцов с использованием коммерчески доступных наборов позволяет случайным образом прикрепить интересующий образец к монослою стрептавидина для получения большего количества потенциальных представлений для решения этой проблемы.
Кроме того, аффинити-сетки стрептавидина обладают преимуществами, уникальными для аффинити-сеток. Высокое сродство и специфичность взаимодействия стрептавидидина с биотином позволяют связывать аффинные решетки стрептавидина с другими рабочими процессами, в которых используется биотин для очистки интересующих комплексов. В одном опубликованном примере авторы иммобилизовали комплекс на аффинных решетках стрептавидина и инкубировали связывающего партнера с неизвестной стехиометрией в большом избытке. После смывания любого несвязанного белка был получен правильно собранный суперкомплекс, который можно было сразу же проанализировать с помощью крио-ЭМ11. Одним из возможных будущих применений может быть комбинирование стрептавидин-связывающих белковых меток, системы Avi-tag или подходов к близкому мечению с аффинными сетками стрептавидина для извлечения отдельных белков и/или белковых комплексов непосредственно из рекомбинантных или эндогенных источников без стандартных сложных схем очистки.
Предоставив этот протокол, лаборатории смогут легко воспроизвести изготовление аффинных сеток стрептавидина и сделать их более часто используемым инструментом для структурного анализа белковых комплексов с помощью крио-ЭМ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T.C. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук на обучение молекулярной биофизике GM-08295 и стипендией Национального научного фонда в рамках гранта DGE 2146752. Р.Г. и Б.Х. были поддержаны грантом Национального института здравоохранения R21-GM135666, присужденным Р.Г. и Б.Х. Эта работа была частично профинансирована за счет гранта R35-GM127018 Национального института общих медицинских наук, присужденного Е.Н. Е.Н. является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. . Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -. G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -. G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
