ייצור רשת Streptavidin-Affinity להכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron

1. הכנת ריאגנטים לדלל סטרפטווידין שנרכש מסחרית לריכוז סופי של 0.5 מ”ג/מ”ל בחיץ התגבשות (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). יש לוודא כי ריכוז הטרהלוז הסופי הוא 10%. הקפאת הבזק aliquots של 25-50 μL בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C. יש להמיס 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) נתרן מלח לתוך 65:35:8 v/v/v כלורופורם/מתנול/ממס מים לקבלת ריכוז שומנים סופי של 1 מ”ג/מ”ל. יש לאחסן Aliquots לשימוש חד פעמי של 20-30 μL ב -80 °C בבקבוקוני זכוכית.הערה: הכנת ממס מדויקת יותר אם היא נעשית לפי משקל. ראשית, שלבו 1.85 גרם מים טהורים במיוחד עם 6.41 גרם מתנול ברמת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) והוסיפו זאת ל-22.42 גרם כלורופורם כדי להכין את הממס.התראה: אנא קרא והבן את גיליונות נתוני הבטיחות של היצרנים ואת ההוראות המומלצות לטיפול וסילוק של ממיסים אורגניים כלורופורם ומתנול לפני תחילת פרוטוקול זה. יש להימנע ממגע ישיר של מתנול עם העור. 2. טיפול מקדים ברשתות שטפו רדיד פחמן על רשתות רשת זהב על ידי טבילה פעמיים ב-100% כלורופורם ופעם אחת ב-100% אתנול. הניחו את הרשתות על נייר מסנן נקי לייבוש. חזרו על תהליך הכביסה במשך שלושה מחזורים בסך הכל.הערה: הצלחה ניתנת לשחזור הושגה באמצעות רשתות רדיד פחמן זמינות מסחרית בעלות סרט פחמן בעובי 10-12 ננומטר (ראה רשימת חומרים) עם גדלי חורים הנעים בין 0.6-2 מיקרומטר. רשתות רדיד זהב זמינות מסחרית ורשתות פחמן חורי תוצרת בית שהוכנו בעקבות פרוטוקול ננו-ייצור14 של מעבדת רובינשטיין שימשו גם הם בהצלחה. תוצאות פחות ניתנות לשחזור הושגו עם רשתות זמינות מסחרית בעלות יריעות פחמן דקות יותר. אין להשתמש ברשתות נחושת, מכיוון שנחושת מגיבה עם אמינים אורגניים שעשויים להימצא בדגימה. לאחר שהרשתות מתייבשות, יש לאדות שכבה בעובי 2.5-5 ננומטר של פחמן לצד הפחמן של רשתות הפחמן החוריות. עובי הפחמן נשלט באמצעות מדידת עובי סרט גבישי קוורץ המובנית במאייד הפחמן המסופק בקובץ טבלת החומרים . אפשרו לפחמן שזה עתה התאדה להזדקן (כלומר, להיות הידרופובי יותר) למשך שבוע אחד. 3. הכנת סריג סטרפטאבידין הערה: כדי לגדל גבישי סטרפטאבידין דו-ממדיים על רשתות EM של פחמן חורי, ראשית, מונו-שכבה של שומנים ביוטיניליים מוחלת על החורים של סרט הפחמן (איור 1B) על-ידי העברת Langmuir-Schaefer. חד-שכבת השומנים נוצרת בעקבות השלבים הבאים (איור 2). אבקת טלק יוצרת גבול בין שמן הקיקיון לצלחת הפטרי, ושכבה דקה של שמן קיק מסייעת לשמור על לחץ פנים קבוע בעת יצירת חד-שכבה של השומנים. הצד המכיל את הפחמן המתאדה משלב 2.2 משמש לאיסוף החד-שכבתי, שומנים עודפים נשטפים באמצעות חיץ התגבשות, ותמיסת סטרפטווידין מודגרת על הרשת לצורך התגבשות. נקו את אזור הספסל עם 70% אתנול. יש לשטוף מזרק זכוכית 5 μL מספר פעמים עם כלורופורם לניקוי. הניחו למזרק להתייבש לחלוטין לפני השימוש. שטפו שוב רשתות שהתאדו בפחמן, כלומר ממש לפני השימוש, על ידי טבילתן באתנול 100%. הניחו לרשתות להתייבש על נייר סינון נקי. בזמן שהרשתות מתייבשות, שטפו כל פינצטה אנטי-נימית עם 100% כלורופורם ו-100% אתנול. הניחו לפינצטה להתייבש לחלוטין. בצד הנקי של הפרפילם, הכינו שלוש טיפות 50 מיקרוליטר של חיץ התגבשות (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) עבור כל רשת שתיווצר. מלאו את המכסה של צלחת פטרי לא מצופה בקוטר 35 מ”מ בחיץ התגבשות (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). נקו את פני השטח בעזרת נייר עדשה. מפזרים אבקת טלק באיכות מדעית סביב היקף צלחת הפטרי. זה משמש לאחר מכן אינדיקטור, בשלב הבא, של כמה רחוק שמן הקיקיון התפשט. הוסיפו מספיק אבקת טלק כדי ליצור מחסום שמגן על שמן הקיקיון מפני נגיעה בשולי צלחת הפטרי. הוספת יותר מדי אבקת טלק מגבילה את השטח הזמין ליצירת שכבה אחידה של השומנים. טבלו קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר בשמן הקיקיון לקבלת טיפה בינונית (כ-20 מיקרוליטר) התלויה מקצה הפיפטה. געו בטיפה זו לפני השטח של החיץ בצלחת הפטרי, שם היא תתפשט ליצירת סרט אחיד. הסרט הדק שנוצר של שמן משמש בוכנה15, אשר שומר על לחץ פני השטח קבוע כאשר monolayer שומנים נוצרת (שלב 3.10).הערה: חשוב להוסיף מספיק שמן קיק ולא מעט מדי, ועדיף להוסיף טיפה אחת. הניחו לשמן הקיקיון להתפשט במלואו לפני יצירת חד-שכבתי השומנים. שטפו את מזרק הזכוכית 5 μL פעם או פעמיים עם השומנים המומסים לפני נטילת aliquot לשימוש. הימנעו מיצירת בועות אוויר בשומנים הממלאים את המזרק.הערה: מזרק הזכוכית נשטף בשומנים מומסים למקרה שנשאר כלורופורם שיורי משלב 3.2. כלורופורם שיורי יכול להשפיע על איכות monolayer וכתוצאה מכך. מוציאים את הנפח הקטן ביותר האפשרי (~0.5 מיקרוליטר) של שומנים מהמזרק ונוגעים בעדינות בטיפה התלויה על פני השטח של סרט שמן הקיק. שימו לב שתמיסת השומנים פורצת דרך סרט שמן הקיקיון בנקודת המגע וכי חד-שכבת השומנים המתקבלת יוצרת עיגול במרכז הסרט הדק של שמן הקיק.הוסיפו כמה טיפות של שומנים ברצף או הוסיפו עוד שומנים לאחר יצירת כמה רשתות, אך אם מוסיפים יותר מדי, השומנים יתפשטו מעבר לגבול שמן הקיק אל תוך ההיקף שבו אבקת הטלק וכל חומר פעילי שטח מזהם נתפסו. במקרה כזה, יהיה צורך להפעיל מחדש את התהליך. הרימו רשת עם פינצטה אנטי-נימית כך שהזרוע הישרה של הפינצטה והצד המתאדה בפחמן של הרשת יפנו שתיהן לחד-שכבה. העבירו חלק מהשכבה החד-שכבתית לפחמן החור על ידי נגיעה בצד המתאדה של הרשת לשכבה החד-שכבתית למשך 1-2 שניות.הערה: העברה מוצלחת מסומנת על ידי כך שפני השטח של הרשת הופכים הידרופיליים, מה שגורם למכסה חיץ דק וכדורי לכסות את כל הרשת לאחר שהיא הוסרה מצלחת הפטרי. געו במכסה הכדורי של החיץ שנצמד כעת לרשת, ברצף למשך שנייה אחת כל אחת, בשלוש טיפות 50 μL של חיץ התגבשות שהוכנו על פרפילם בשלב 3.5.הערה: שלב זה מנסה להסיר ככל האפשר את עודפי השומנים, המכסים את פני השטח של המכסה הכדורי (ולא את סרט הפחמן ההידרופובי לשעבר), על מנת למנוע היווצרות של בועיות שומנים כאשר דגימות נצפות במיקרוסקופ אלקטרונים. הוסף בזהירות 4 μL של סטרפטאווידין 0.5 מ”ג / מ”ל לתוך המכסה הכדורי הנותר של חיץ התגבשות על הרשת. הניחו את הרשת בתא לחות. חזור על שלבים 3.11-3.14 עבור כל קבוצת הרשתות. דגרו על הרשתות בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעתיים בתוך תא לחות כדי למנוע אידוי.הערה: חשוב שהצד המוזהב של הרשת לא יירטב בשום שלב לאחר מריחת השכבה החד-שכבתית. לאחר הדגירה של שעתיים, הכינו טיפה אחת של 300 מיקרוליטר של חיץ שטיפה (10 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) לכל רשת בצד הנקי של הפרפילם.הערה: מאגר השטיפה מכיל 50 mM KCl במקום 150 mM KCl, שנמצא במאגר ההתגבשות המשמש לשלבים 3.5-3.6. שטפו את עודפי הסטרפטאווידין (הלא קשורים) על ידי הנחת הרשת על טיפת 300 מיקרוליטר של מאגר השטיפה. בצע את שלבים 3.18-3.20 עבור רשת אחת בכל פעם. הימנע מהשארת הרשתות על טיפת מאגר השטיפה של 300 μL לפרקי זמן ממושכים.הערה: רק שטיפה אחת מבוצעת מכיוון שקריסטל הסטרפטאבידין/מונושכבה שביר בשלב זה. בכל פעם שמרימים רשת מפני השטח של טיפת חיץ כביסה, גשר הנוזלים בין הרשת לטיפת הכביסה נקרע. בזמן הקרע, שיפוע לחץ חולף (לחץ יניקה) מוחל על גבישים חד-שכבתיים הנתמכים על ידי עצמם המשתרעים על פני החורים הפתוחים של סרט הפחמן. לחץ יניקה זה צפוי לגרום לכיפה חולפת של הגביש החד-שכבתי, המלווה בהתרחבות השטח המכוסה על ידי הגבישים. אם הגידול בשטח חורג מהגבול האלסטי של הגביש, הגביש עלול להישבר או להיות לא מסודר. יבש מיד את הפינצטה נגד נימים עם מגבון ללא סיבים כדי להקל על שחרור הרשת על נייר סינון בשלב הבא. הרימו את הרשת הצפה על טיפת חיץ השטיפה על ידי הדבקת הזרוע המעוקלת של הפינצטה האנטי-נימית לתוך הטיפה. הרחיקו את המאגר העודף בעדינות מהצד בעזרת נייר פילטר. הניחו את הרשת על נייר סינון עם צד הזהב כלפי מטה, חזרו על שלבים 3.18-3.20 עבור כל רשת, ואפשרו לרשתות להתייבש במשך 15-20 דקות. לאחר שהרשתות יבשות, הפכו אותן כך שצד הזהב פונה כעת כלפי מעלה. התאדו שכבה דקה של פחמן (בעובי של 0.5-2 ננומטר) על הצד המוזהב של הרשתות.הערה: אחסן רשתות בלחות קבועה, שערכה אינו משנה, וציין כי שינויים מרובים בלחות היחסית צפויים לגרום למחזורי התרחבות והתכווצות. אפשר לרשתות להתיישן במשך שבוע לפני השימוש ב- cryo-EM לקבלת התוצאות הטובות ביותר מכיוון שההידרופוביות של הצד האחורי של הרשת עשויה להיות חשובה ליציבות חד-שכבתית. הרשתות יציבות לפרקי זמן ארוכים, אך לאחר 3 חודשים, הפחמן האחורי עשוי להיות פחות הידרופובי. 4. בדיקת איכות אצווה של רשת זיקה סטרפטאבידין על ידי כתם שלילי הכינו שתי טיפות של 50 μL וטיפה אחת של 100 μL של חיץ דגימה (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) בצד הנקי של הפרפילם. הסר את רשתות הטרהלוז והרט סטרפטאבידין על ידי נגיעה בשתי טיפות 50 μL ותן לרשת לצוף על טיפת 100 μL של מאגר הדגימה למשך 10 דקות.הערה: עדיף להימנע משימוש בחומר ניקוי במהלך ההתייבשות והדגירות הבאות של קשירת הדגימה. החיץ יתפזר לצד הזהב של הרשתות ויגביל את יעילות השטיפות כדי להסיר דגימות עודפות. לאחר החזרת נוזלים, הרימו את הרשת עם פינצטה אנטי נימית, כך שהזרוע המחוטבת של הפינצטה האנטי נימית נמצאת בטיפה. כתם בעדינות את המאגר העודף הרחק מהצד והחל מחדש במהירות 4 μL של דגימה של 75-100 ננומטר (אופציונלי).הערה: הימנע מלתת לרשת להתייבש לאחר התייבשות. יש לדגור על הדגימה בתא לחות למשך 1-5 דקות.הערה: זמני הריכוז והדגירה יהיו תלויי דגימה ויש למטב אותם. ריכוז הדגימה המסופק וזמן הדגירה מוצעים לנקודות התחלה. בצד הנקי של הפרפילם, יש לטפטף ארבע טיפות של 30 μL כל אחת הן של חיץ הדגימה והן של כתם 1% אורניל פורמט (UF).הערה: אנא קרא והבן את גיליונות נתוני הבטיחות של היצרנים ואת ההוראות המומלצות לטיפול וסילוק של פורמט אורניל לפני ביצוע שלב זה. פורמט אורניל הוא תרכובת רעילה ורדיואקטיבית. יש להקפיד על קבלת אישור מוסדי מראש לשימוש בחומר רדיואקטיבי. שטפו את הדגימה הלא מאוגדת על ידי נגיעה בכל אחת מארבע טיפות מאגר הדגימה. הכתימו את הדגימה באמצעות הליכי כתמים שליליים סטנדרטיים עם UF. כתם בעדינות את כתם UF מהצד, משאיר שכבה עבה מאוד של כתם על הרשת. ניתן למרוח 0.5 מיקרוליטר נוסף של כתם על הרשת לאחר הכתמה כדי להפוך את הכתם לעבה יותר במידת הצורך. אפשרו לרשת להתייבש באוויר.הערה: מכיוון שרשתות הסטרפטאבידין הן הידרופיליות מאוד, כתם שלילי נוטה ליצור סרט אחיד מאוד בכל מקום, בניגוד למה שנראה בדרך כלל בשימוש ברשתות פחמן רציפות המטופלות בפריקת זוהר. כתוצאה מכך, מומלץ להשאיר סרט עבה יותר של תמיסת כתמים. 5. הקפאת רשתות זיקה סטרפטאבידין עם דגימות ביוטינילציה הערה: ההליך הבא מיועד לבוכנה אוטומטית חד-צדדית המכילה חיישן הדבקה פנימי (ניתן גם לבצע ניקוי ידני חד-צדדי במנגנון צלילה אוטומטי אחר) הכינו שתי טיפות של 50 μL וטיפה אחת של 100 μL של חיץ דגימה (למשל, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) בצד הנקי של הפרפילם. התייבשו רשתות סטרפטווידין על ידי נגיעה בשתי טיפות 50 μL ותנו לרשת לצוף על טיפת 100 μL של מאגר הדגימה למשך 10 דקות. לאחר החזרת נוזלים, הרימו את הרשת עם פינצטה אנטי נימית, כך שהזרוע המחוטבת של הפינצטה האנטי נימית נמצאת בטיפה. יש לכתם בעדינות את המאגר העודף הרחק מהצד ולמרוח במהירות 4 μL של דגימה של 75-100 ננומטר. יש לדגור על הדגימה בתא לחות למשך 1-5 דקות.הערה: שוב, זמני הריכוז והדגירה יהיו תלויי דגימה ויש לייעל אותם. ריכוז הדגימה המסופק וזמן הדגירה מוצעים לנקודות התחלה. עבור דגימות בריכוזים נמוכים ניתן לדגור לפרקי זמן ארוכים יותר ו/או לקשור את הדגימה לרשתות מספר פעמים. הכינו שתי טיפות של 10 μL של חיץ הקפאה (למשל, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, 3% trehalose, 0.01% NP40) בצד הנקי של parafilm. לאחר הדגירה, שטפו את הדגימה הלא מאוגדת על ידי נגיעה ברשת עד לטיפה הראשונה של מאגר ההקפאה. שחרר את הרשת על הטיפה השנייה של מאגר ההקפאה. תפסו במהירות את קצה הרשת עם הפינצטה המחוברת לבוכנה האוטומטית החד-צדדית. מחק בעדינות את המאגר העודף והחל במהירות 4 μL של מאגר הקפאה (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, 3% trehalose, 0.01% NP40) על הרשת. חברו פינצטה לבוכנה האוטומטית החד-צדדית. התוצאות הטובות ביותר הושגו באמצעות חיישן כתם המזהה את טיפת הנוזל על הרשת עם זמני כתם בין 4-6 שניות. התנאים ישתנו בהתאם לדגימה ולמאגר שבו נעשה שימוש. 6. עיבוד נתונים של סרטי cryo-EM שנאספו מרשתות זיקה סטרפטאווידין איסוף נתונים על רשתות זיקה סטרפטאבידין יכול להתבצע כמו ברשתות סטנדרטיות, ואין צורך בהתאמות מיקרוסקופ מיוחדות. עם זאת, ההליך המפורט כאן מסיר את אות הסטרפטאבידין רק לאחר תיקון תנועה של המיקרוגרף. לכן, לא ניתן לבצע באופן מהימן שלבי עיבוד נתונים, כגון ליטוש חלקיקים, המסתמכים על מסגרות סרט מקוריות. חיסור אות סטרפטאבידין (נדרש עבור כל עיבוד סטנדרטי במורד הזרם, למעט הערכת CTF) כאן דורש Matlab גרסה R2014b או חדשה יותר הפועלת בסביבת לינוקס. חיסור האות מסתמך על האופי הגבישי של שכבת הסטרפטאווידין, המאפשר מיסוך שיא, ומכאן הסרת אות מהתמרת פורייה של כל מיקרוגרף. הגדרת סקריפטי העיבודהעתק את כל הקבצים מקבצים משלימים לתיקייה ייעודית בספריית הפרויקט הכן ספריה בשם processing_scripts הכוללת את הקבצים הבאים:lsub.m (קובץ קידוד משלים 1; סקריפט החיסור)process_subtration.sh (קובץ קידוד משלים 2; סקריפט עטיפה שעובר בלולאה על כל המיקרוגרפים הזמינים, משריץ עבודות מקבילות ועוקב אחר הקלט והפלט)process_subtraction.cfg (קובץ קידוד משלים 3; קובץ תצורה המכיל את הפרמטרים עבור משימת החיסור, ראה 6.2) הכן ספריה בשם support_scripts הכוללת את הקבצים הבאים:bg_drill_hole.m (קובץ קידוד משלים 4)bg_FastSubtract_standard.מ (קובץ קידוד משלים 5)bg_Pick_Amp_masked_standard.m (קובץ קידוד משלים 6)bg_push_by_rot.מ (קובץ קידוד משלים 7)ReadMRC.m (קובץ קידוד משלים 8)WriteMRC.m (קובץ קידוד משלים 9)WriteMRCHeader.m (קובץ קידוד משלים 10) התאם את קובץ התצורה לפי הצורך (process_subtraction.cfg, (עיין באיור 3) לפי הצורך:קלט: נתיב לספרייה המכילה את המיקרוגרפים המתוקנים בתבנית MRC. השתמש בספריה או בתבנית כולל תווים כלליים (?, *).דוגמה:input=”/path/to/project_directory/micrographs/”אוinput=”/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc” output_dir: נתיב לספרייה שאליה יש לכתוב את הסריג החסר מיקרוגרפים. only_do_unfinished: ציין (true|false) אם יש להחליף או לדלג על מיקרוגרפים קיימים שהוחסרו מראש. פרמטר זה שימושי להפעלת סקריפט חיסור הסריג באמצע הפעלת מיקרוסקופ (ברירת מחדל: true). num_parallel_jobs: ציין את מספר המשימות המקבילות. מספר זה תלוי במפרטי החומרה המשמשים לעיבוד ולא אמור להיות גבוה ממספר הליבות הזמינות. במערכות עם 32 ליבות ומערכת קבצים ברשת, ביצועים אופטימליים הושגו עם 14 עבודות מקבילות. לקבלת הביצועים הטובים ביותר, מטב ערך זה עם קבוצת משנה של מיקרוגרפים. Pad_Origin_X: 200 עבור גלאי K3 בכיוון לאורך (רוחב תמונה גובה תמונה). FFT מבוצע בקופסאות מרובעות וריפוד נדרש אם הגלאי הוא בעל ממדים שאינם מרובעים. Pad_Origin_Y: 1000 לגלאי K3 בכיוון לאורך (רוחב תמונה גובה תמונה). אל תשנה את Inside_Radius_Ang (90) ואת Outside_Radius_Ang (3.0). חיסור הסריג מתבצע בין שתי רזולוציות (היחידה נמצאת באנגסטרום). Pixel_Ang: ספק את גודל הפיקסלים כערך נקודה צפה. סף: ערך חיתוך סף חיסור להחלפת הסריג ברקע במרחב פורייה. הערכים בשימוש מוצלח הם בין 1.4-1.6. השתמש ב- 1.42 כנקודת התחלה. אל תשנה expand_pixel (10) ו- pad_out_opt (0). expand_pixel הוא ערך קוטר המשמש למסיכה סביב פיקסלים עם ערכים גבוהים מסף הסף. pad_out_opt היא אפשרות המחליטה אם אזור מרופד ייכלל בפלט. addpath_m: נתיב אל סקריפטי התמיכה. path_to_matlab_bin: נתיב לספריית סל ההתקנה Matlab של המערכת. path_matlab_script: נתיב לסקריפט החיסור של matlab (lsub.m) שהועתק לעיל בשלב 6.1.2. לאחר שמירת הסקריפט שהשתנה, הפעל את הסקריפט (bash ./process_subtraction.sh ) כדי להחסיר את אות הסטרפטאווידין מהמיקרוגרפים של הקלט. ניתן להפסיק את קובץ ה-script ו/או להפעיל אותו מחדש אם only_do_unfinished הפרמטר מוגדר כ- true (ראה בשלב 6.2.3). אם מתרחשת שגיאה, סקור את הפרמטרים שצוינו בסקריפט bash. ודא שאין רווחים לא מכוונים בין משתני הפרמטרים לבין הערכים שהוקצו להם, מכיוון שזהו מקור נפוץ לטעויות. השתמש בסריג שהוחסרו תמונות לעיבוד תמונה סטנדרטי של cryo-EM.