Kriyo-Elektron Mikroskobu Numune Hazırlama için Streptavidin-Afinite Izgarası İmalatı

1. Reaktiflerin hazırlanması Ticari olarak satın alınan streptavidini kristalizasyon tamponunda (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA,% 10 trehaloz) 0.5 mg / mL’lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Son trehaloz konsantrasyonunun% 10 olduğundan emin olun. 25-50 μL’lik alikotları sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve -80 °C’de saklayın. 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(biyotinil) sodyum tuzunu 65:35:8 v/v/v kloroform/metanol/su çözücü içinde 1 mg/mL’lik bir nihai lipit konsantrasyonu için çözün. 20-30 μL’lik tek kullanımlık alikotları -80 °C’de cam şişelerde saklayın.NOT: Çözücünün hazırlanması ağırlıkça yapılırsa daha doğrudur. İlk olarak, 1.85 g ultra saf suyu 6.41 g yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı metanol ile birleştirin ve çözücüyü hazırlamak için bunu 22.42 g kloroforma ekleyin.DİKKAT: Bu protokole başlamadan önce lütfen üreticilerin güvenlik bilgi formlarını ve kloroform ve metanol organik çözücülerin taşınması ve atılması için önerilen talimatları okuyun ve anlayın. Metanolün cilt ile doğrudan temasından kaçının. 2. Izgaraların ön işlemi Karbon folyoyu iki kez% 100 kloroforma ve bir kez% 100 etanole batırarak altın örgü ızgaralarda yıkayın. Izgaraları kuruması için temiz filtre kağıdına yerleştirin. Yıkama işlemini toplam üç döngü boyunca tekrarlayın.NOT: 0,6-2 μm arasında değişen delik boyutlarına sahip 10-12 nm kalınlığında karbondan bir karbon filme (malzeme listesine bakın) sahip ticari olarak temin edilebilen karbon folyo ızgaralarla tekrarlanabilir başarı elde edilmiştir. Rubinstein Laboratuvarı’nın nanofabrikasyon protokolü14’e göre hazırlanan ticari olarak temin edilebilen altın folyo ızgaralar ve ev yapımı delikli karbon ızgaralar da başarıyla kullanılmıştır. Daha ince karbon filmlere sahip ticari olarak temin edilebilen ızgaralarla daha az tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir. Bakır, numunede bulunabilecek herhangi bir organik aminle reaksiyona girdiğinden bakır ızgaralar kullanmayın. Izgaralar kuruduktan sonra, delikli karbon ızgaraların karbon tarafına 2.5-5 nm kalınlığında bir karbon tabakası buharlaştırın. Karbon kalınlığı, Malzeme Tablosu dosyasında sağlanan karbon buharlaştırıcıya yerleştirilmiş kuvars kristal film kalınlığı ölçümü ile kontrol edilir. Yeni buharlaşan karbonun 1 hafta boyunca yaşlanmasına (yani daha hidrofobik olmasına) izin verin. 3. Streptavidin kafesinin hazırlanması NOT: Deley-karbon EM ızgaraları üzerinde 2D streptavidin kristalleri yetiştirmek için, önce Langmuir-Schaefer transferi ile karbon filmin deliklerine (Şekil 1B) biyotinillenmiş bir lipid tek tabakası uygulanır. Lipid tek tabakası, sonraki adımları takiben oluşturulur (Şekil 2). Talk pudrası, hint yağı ile Petri kabı arasında bir sınır oluşturur ve ince bir hint yağı tabakası, lipit tek tabakası oluştuğunda sabit yüzey basıncının korunmasına yardımcı olur. Adım 2.2’den buharlaştırılmış karbonu içeren taraf, tek tabakayı almak için kullanılır, fazla lipitler kristalizasyon tamponu ile yıkanır ve streptavidin çözeltisi kristalizasyon için ızgara üzerinde inkübe edilir. Tezgah alanını etanol ile temizleyin. Temizlemek için 5 μL’lik bir cam şırıngayı kloroform ile birkaç kez durulayın. Kullanmadan önce şırınganın tamamen kurumasını bekleyin. Karbonla buharlaştırılmış ızgaraları tekrar, yani kullanımdan hemen önce 0 etanole batırarak yıkayın. Izgaraları temiz filtre kağıdı üzerinde kurumaya bırakın. Izgaralar kururken, her bir kılcal cımbızı 0 kloroform ve 0 etanol ile yıkayın. Cımbızın tamamen kurumasını bekleyin. Parafilmin temiz tarafında, yapılacak her ızgara için üç adet 50 μL damla kristalizasyon tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, trehaloz) hazırlayın. 35 mm’lik kaplamasız Petri kabının kapağını kristalizasyon tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, trehaloz) ile doldurun. Yüzeyi lens kağıdı ile temizleyin. Petri kabının çevresine bilimsel düzeyde talk pudrası serpin. Bu daha sonra, bir sonraki adımda, hint yağının ne kadar yayıldığının bir göstergesi olarak hizmet eder. Hint yağının Petri kabının kenarına temas etmesini önleyen bir bariyer oluşturmak için yeterince talk pudrası ekleyin. Çok fazla talk pudrası eklemek, lipit tek tabakasını oluşturmak için mevcut alanı sınırlar. Pipet ucundan sarkan orta büyüklükte bir damla (yaklaşık 20 μL) elde etmek için 200 μL’lik bir pipet ucunu hint yağına batırın. Bu damlayı Petri kabındaki tamponun yüzeyine dokundurun, burada düzgün bir film oluşturmak için yayılacaktır. Elde edilen ince yağ filmi, bir lipit tek tabakası oluştuğunda sabit bir yüzey basıncını koruyan bir piston15 görevi görür (adım 3.10).NOT: Çok az değil, yeterli miktarda hint yağı eklemek önemlidir ve tek bir damla olarak eklemek daha iyidir. Lipid tek tabakasını yapmadan önce hint yağının tamamen yayılmasına izin verin. Kullanmak için bir alikot almadan önce 5 μL’lik cam şırıngayı çözünmüş lipid ile bir veya iki kez durulayın. Şırıngayı dolduran lipitte hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.NOT: Cam şırınga, adım 3.2’den itibaren herhangi bir kloroform kalıntısı kalması durumunda çözünmüş lipid ile durulanır. Artık kloroform, elde edilen tek tabakanın kalitesini etkileyebilir. Şırıngadan mümkün olan en küçük hacmi (~ 0.5 μL) lipit dağıtın ve asılı damlacığı hint yağı filminin yüzeyine hafifçe dokundurun. Lipid çözeltisinin temas noktasında hint yağı filmini kırdığına ve ortaya çıkan lipid tek tabakasının ince hint yağı filminin merkezinde bir daire oluşturduğuna dikkat edin.Sırayla birkaç damla lipit ekleyin veya bazı ızgaralar yaptıktan sonra daha fazla lipit ekleyin, ancak çok fazla eklenirse, lipit hint yağının sınırını geçecek ve talk pudrası ve herhangi bir kirletici yüzey aktif maddenin tutulduğu çevreye yayılacaktır. Böyle bir durumda, işlemin yeniden başlatılması gerekir. Kılcal cımbız önleyici bir cımbızla bir ızgara alın, böylece cımbızın düz kolu ve ızgaranın karbonla buharlaşan tarafı tek katmana bakar. Izgaranın karbonla buharlaşan tarafına 1-2 saniye boyunca tek katmana dokundurarak tek katmanın bir kısmını delikli karbona aktarın.NOT: Başarılı aktarım, ızgaranın yüzeyinin hidrofilik hale gelmesiyle gösterilir ve Petri kabından kaldırıldıktan sonra ince, küresel bir tampon kapağının tüm ızgarayı kaplamasına neden olur. Şimdi ızgaraya yapışan tamponun küresel kapağına, her biri 1 saniye boyunca, adım 3.5’te parafilm üzerinde hazırlanan üç adet 50 μL damla kristalizasyon tamponuna dokunun.NOT: Bu adım, numuneler elektron mikroskobunda görüntülendiğinde lipid veziküllerinin oluşumunu önlemek için küresel başlığın yüzeyini (eski hidrofobik karbon filmi yerine) kaplayan fazla lipidi mümkün olduğunca çıkarmaya çalışır. Izgarada kalan küresel kristalizasyon tamponu kapağına dikkatlice 4 μL 0.5 mg / mL streptavidin ekleyin. Izgarayı bir nem odasına yerleştirin. Tüm ızgara grubu için 3.11-3.14 arasındaki adımları tekrarlayın. Buharlaşmayı önlemek için ızgaraları oda sıcaklığında (RT) bir nem odası içinde 2 saat inkübe edin.NOT: Izgaranın altın tarafının, tek katman uygulandıktan sonra herhangi bir noktada ıslanmaması önemlidir. 2 saatlik inkübasyondan sonra, parafilmin temiz tarafındaki her ızgara için 300 μL’lik bir damla durulama tamponu (10 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, trehaloz) hazırlayın.NOT: Durulama tamponu, 3.5-3.6 adımları için kullanılan kristalizasyon tamponunda bulunan 150 mM KCl yerine 50 mM KCl içerir. Izgarayı 300 μL’lik durulama tamponuna yerleştirerek fazla (bağlanmamış) streptavidini yıkayın. Bir kerede bir ızgara için 3.18-3.20 adımlarını gerçekleştirin. Izgaraları 300 μL durulama tamponu damlasında uzun süre bırakmaktan kaçının.NOT: Streptavidin kristali/tek tabakası bu noktada kırılgan olduğu için sadece bir yıkama yapılır. Bir ızgara, bir damla yıkama tamponunun yüzeyinden her kaldırıldığında, ızgara ile yıkama damlası arasındaki sıvı köprü yırtılır. Kopma anında, karbon filmin açık deliklerini kaplayan kendinden destekli tek katmanlı kristallere geçici bir basınç gradyanı (emme basıncı) uygulanır. Bu emme basıncının, kristallerin kapladığı alanın genişlemesiyle birlikte tek tabakalı kristalin geçici kubbesine neden olması beklenir. Alandaki artış kristalin elastik sınırını aşarsa, kristal kırılabilir veya düzensiz hale gelebilir. Bir sonraki adımda ızgaranın filtre kağıdına bırakılmasını kolaylaştırmak için kılcal cımbızları tüy bırakmayan bir bezle hemen kurulayın. Kılcal cımbızın bükülmüş kolunu damlaya sokarak durulama tamponu damlası üzerinde yüzen ızgarayı alın. Fazla tamponu filtre kağıdıyla yandan nazikçe kurulayın. Izgarayı altın tarafı aşağı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirin, her ızgara için 3.18-3.20 adımlarını tekrarlayın ve ızgaraların 15-20 dakika kurumasını bekleyin. Izgaralar kuruduktan sonra, altın tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin. İnce bir karbon tabakasını (yaklaşık 0.5-2 nm kalınlığında) ızgaraların altın tarafına buharlaştırın.NOT: Izgaraları, değeri önemli görünmeyen sabit bir nemde saklayın, bağıl nemdeki birden fazla değişikliğin genleşme ve büzülme döngülerine neden olmasının beklendiğine dikkat edin. En iyi sonuçlar için cryo-EM kullanımından önce ızgaraların 1 hafta yaşlanmasına izin verin çünkü ızgaranın arka tarafının hidrofobikliği tek katmanlı stabilite için önemli olabilir. Izgaralar uzun süre stabildir, ancak 3 ay sonra arka taraftaki karbon daha az hidrofobik hale gelebilir. 4. Streptavidin afinite ızgarası parti kalitesinin negatif leke ile kontrol edilmesi Parafilmin temiz tarafında iki damla 50 μL ve bir damla 100 μL numune tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) hazırlayın. İki 50 μL’lik damlaya dokunarak trehalozu çıkarın ve streptavidin ızgaralarını rehidre edin ve ızgarayı 100 μL’lik numune tamponu damlası üzerinde 10 dakika yüzdürün.NOT: Rehidrasyon ve müteakip numune bağlama inkübasyonları sırasında deterjan kullanmaktan kaçınmak en iyisidir. Tampon, ızgaraların altın tarafına dağılacak ve fazla numuneleri çıkarmak için yıkamaların verimliliğini sınırlayacaktır. Yeniden sulandırdıktan sonra, kılcal cımbızın bükülmüş kolu damlada olacak şekilde ızgarayı kılcal bir cımbızla alın. Fazla tamponu yandan nazikçe kurulayın ve 4 μL 75-100 nM numuneyi (isteğe bağlı) hızla yeniden uygulayın.NOT: Rehidrasyondan sonra ızgaranın kurumasına izin vermeyin. Numuneyi bir nem odasında 1-5 dakika inkübe edin.NOT: Konsantrasyon ve inkübasyon süreleri numuneye bağlı olacaktır ve optimize edilmelidir. Sağlanan numune konsantrasyonu ve inkübasyon süresi önerilen başlangıç noktalarıdır. Parafilmin temiz tarafında, her biri 30 μL’lik dört damla hem numune tamponu hem de %1 uranil format (UF) boyası ayarlayın.NOT: Bu adımı gerçekleştirmeden önce lütfen üreticilerin güvenlik veri sayfalarını ve uranil formatın taşınması ve atılması için önerilen talimatları okuyun ve anlayın. Uranil format toksik ve radyoaktif bir bileşiktir. Radyoaktif malzeme kullanımı için önceden kurumsal onay aldığınızdan emin olun. Bağlanmamış numuneyi, dört damla numune tamponunun her birine dokunarak yıkayın. UF ile standart negatif boyama prosedürlerini kullanarak numuneyi boyayın. UF lekesini yandan nazikçe kurulayın ve ızgara üzerinde çok kalın bir leke tabakası bırakın. Gerekirse lekeyi kalınlaştırmak için lekelemeden sonra ızgaraya ek 0,5 μL leke uygulanabilir. Izgaranın kurumasını bekleyin.NOT: Streptavidin ızgaraları çok hidrofilik olduğundan, negatif leke, kızdırma deşarjı ile işlenmiş, sürekli karbon ızgaraları kullanıldığında yaygın olarak görülenin aksine, her yerde çok düzgün bir film oluşturma eğilimindedir. Sonuç olarak, daha kalın bir leke çözeltisi filmi bırakılması önerilir. 5. Streptavidin afinite ızgaralarının biyotinillenmiş örneklerle dondurulması NOT: Aşağıdaki prosedür, dahili bir lekeleme sensörü içeren tek taraflı otomatik bir piston için tasarlanmıştır (diğer otomatik dalma aparatlarında tek taraflı manuel lekeleme de mümkündür) Parafilmin temiz tarafında iki damla 50 μL ve bir damla 100 μL numune tamponu hazırlayın (örneğin, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP). İki 50 μL’lik damlaya dokunarak streptavidin ızgaralarını rehidre edin ve ızgaranın 100 μL’lik numune tamponu damlası üzerinde 10 dakika boyunca yüzmesine izin verin. Yeniden sulandırdıktan sonra, kılcal cımbızın bükülmüş kolu damlada olacak şekilde ızgarayı kılcal bir cımbızla alın. Fazla tamponu kenardan nazikçe kurulayın ve hızlı bir şekilde 4 μL 75-100 nM numune uygulayın. Numuneyi bir nem odasında 1-5 dakika inkübe edin.NOT: Yine, konsantrasyon ve inkübasyon süreleri numuneye bağlı olacaktır ve optimize edilmelidir. Sağlanan numune konsantrasyonu ve inkübasyon süresi önerilen başlangıç noktalarıdır. Düşük konsantrasyonlardaki numuneler için, daha uzun süreler boyunca inkübe edilebilir ve/veya numune ızgaralara birkaç kez bağlanabilir. Parafilmin temiz tarafında iki adet 10 μL damla dondurma tamponu (örneğin, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, %3 trehaloz, %0.01 NP40) hazırlayın. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış numuneyi ızgaraya donma tamponunun ilk damlasına dokunarak yıkayın. Izgarayı dondurma tamponunun ikinci damlasına bırakın. Tek taraflı otomatik pistona takılı cımbızla ızgaranın kenarını hızla kavrayın. Fazla tamponu nazikçe kurulayın ve ızgaraya hızlı bir şekilde 4 μL dondurma tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, %3 trehaloz, %0.01 NP40) uygulayın. Cımbızı tek taraflı otomatik pistona takın. En iyi sonuçlar, 4-6 s arasındaki leke süreleriyle ızgaradaki sıvı damlasını algılayan bir leke sensörü kullanılarak elde edilmiştir. Koşullar, kullanılan numuneye ve tampona bağlı olarak değişecektir. 6. Streptavidin afinite ızgaralarından toplanan kriyo-EM filmlerinin veri işlemesi Streptavidin afinite ızgaraları üzerinde veri toplama, standart ızgaralarda olduğu gibi gerçekleştirilebilir ve özel mikroskop ayarlamalarına gerek yoktur. Bununla birlikte, burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, streptavidin sinyalini yalnızca mikrografın hareket düzeltmesinden sonra kaldırır. Bu nedenle, orijinal film karelerine dayanan parçacık parlatma gibi veri işleme adımları güvenilir bir şekilde gerçekleştirilemez. Buradaki streptavidin sinyal çıkarma (CTF tahmini hariç tüm standart aşağı akış işlemleri için gereklidir), bir Linux ortamında çalışan Matlab sürüm R2014b veya daha yenisini gerektirir. Sinyal çıkarma, streptavidin tabakasının kristal doğasına dayanır, bu da tepe maskelemesine ve dolayısıyla her mikrografın Fourier dönüşümünden sinyal çıkarılmasına izin verir. İşleme komut dosyalarını ayarlamaEk Dosyalar’daki tüm dosyaları proje dizini içindeki özel bir klasöre kopyalayın Aşağıdaki dosyaları içeren processing_scripts adlı bir dizin hazırlayın:lsub.m (Ek Kodlama Dosyası 1; çıkarma komut dosyası)process_subtration.sh (Ek Kodlama Dosyası 2; mevcut tüm mikrograflar üzerinde döngü yapan, paralel işler ortaya çıkaran ve giriş ve çıktıyı izleyen sarmalayıcı komut dosyası)process_subtraction.cfg (Ek Kodlama Dosyası 3; çıkarma işinin parametrelerini içeren yapılandırma dosyası, bkz. 6.2) Aşağıdaki dosyaları içeren support_scripts adlı bir dizin hazırlayın:bg_drill_hole.m (Ek Kodlama Dosyası 4)bg_FastSubtract_standard.m (Ek Kodlama Dosyası 5)bg_Pick_Amp_masked_standard.m (Ek Kodlama Dosyası 6)bg_push_by_rot.m (Ek Kodlama Dosyası 7)ReadMRC.m (Ek Kodlama Dosyası 8)WriteMRC.m (Ek Kodlama Dosyası 9)WriteMRCHeader.m (Ek Kodlama Dosyası 10) Yapılandırma dosyasını gerektiği gibi ayarlayın (process_subtraction.cfg, ( bkz. Şekil 3):Giriş: mrc formatında hareket düzeltmeli mikrografları içeren dizinin yolu. Joker karakterler (?, *) içeren bir dizin veya desen kullanın.Örnek:input=”/path/to/project_directory/micrographs/”veyainput=”/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc” output_dir: Kafes çıkarılan mikrografların yazılması gereken dizinin yolu. only_do_unfinished: Önceden var olan çıkarılmış mikrografların üzerine yazılması veya atlanması gerekip gerekmediğini belirtin (doğru|yanlış). Bu parametre, bir mikroskop oturumunun ortasında kafes çıkarma komut dosyasını başlatmak için kullanışlıdır (varsayılan: true). num_parallel_jobs: Paralel işlerin sayısını belirtin. Bu sayı, işleme için kullanılan donanım özelliklerine bağlıdır ve mevcut çekirdek sayısından daha yüksek olmamalıdır. 32 çekirdeğe ve bir ağ dosya sistemine sahip sistemlerde, 14 paralel işle optimum performans elde edildi. En iyi performans için, bu değeri bir mikrograf alt kümesiyle optimize edin. Pad_Origin_X: Dikey yönde (görüntü genişliği görüntü yüksekliği) bir K3 dedektörü için 1000. FFT kare kutularda gerçekleştirilir ve dedektörün kare olmayan boyutları varsa dolgu gereklidir. Pad_Origin_Y: Dikey yönde (görüntü genişliği görüntü yüksekliği) bir K3 dedektörü kullanıldığında 200. Inside_Radius_Ang (90) ve Outside_Radius_Ang (3.0) değiştirmeyin. Kafes çıkarma işlemi iki çözünürlük arasında gerçekleştirilir (birim angstrom cinsindendir). Pixel_Ang: Piksel boyutunu kayan nokta değeri olarak sağlayın. Eşik: Fourier uzayında kafesi arka planla değiştirmek için çıkarma eşiği kesme değeri. Başarıyla kullanılan değerler 1.4-1.6 arasındadır. Başlangıç noktası olarak 1.42’yi kullanın. (10) ve pad_out_opt (0) expand_pixel değiştirmeyin. expand_pixel, eşik sınırından daha yüksek değerlere sahip piksellerin etrafını maskelemek için kullanılan bir çap değeridir. pad_out_opt, yastıklı bir alanın çıktıya dahil edilip edilmeyeceğine karar veren bir seçenektir. addpath_m: Destek betiklerinin yolu. path_to_matlab_bin: Sistemin Matlab kurulum bin dizininin yolu. path_matlab_script: Yukarıda 6.1.2 adımında kopyalanan matlab çıkarma betiğine (lsub.m) giden yol. Değiştirilen komut dosyasını kaydettikten sonra, streptavidin sinyalini giriş mikrograflarından çıkarmak için komut dosyasını (bash ./process_subtraction.sh ) çalıştırın. only_do_unfinished parametresi true olarak ayarlanırsa komut dosyası kesintiye uğratılabilir ve/veya yeniden başlatılabilir (bkz. adım 6.2.3). Bir hata oluşursa, bash betiğinde belirtilen parametreleri gözden geçirin. Parametre değişkenleri ile atanmış değerleri arasında istenmeyen boşluklar olmadığından emin olun, çünkü bu yaygın bir hata kaynağıdır. Standart cryo-EM görüntü işleme için kafes çıkarılmış görüntüleri kullanın.