Summary

تنظيم نمو خلايا شوان بواسطة المجال الكهربائي النبضي نانو ثانية لتجديد الأعصاب الطرفية في المختبر

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتطبيق المجال الكهربائي لنبضة النانو ثانية (nsPEF) لتحفيز خلايا شوان في المختبر. أثبتت قدرة التوليف والإفراز للعوامل ذات الصلة وتغييرات سلوك الخلية صحة التحفيز الناجح باستخدام nsPEF. تعطي الدراسة نظرة إيجابية لطريقة تجديد الأعصاب الطرفية.

Abstract

خلايا شوان (SCs) هي خلايا الميالين في الجهاز العصبي المحيطي ، وتلعب دورا مهما في تجديد الأعصاب الطرفية. المجال الكهربائي لنبض النانو ثانية (nsPEF) هو طريقة ناشئة قابلة للتطبيق في التحفيز الكهربائي للأعصاب والتي أثبتت فعاليتها في تحفيز تكاثر الخلايا والعمليات البيولوجية الأخرى. بهدف تقييم ما إذا كانت SCs تخضع لتغييرات كبيرة في إطار nsPEF والمساعدة في استكشاف إمكانات طرق جديدة لتجديد الأعصاب المحيطية ، تعرضت خلايا RSC96 المستزرعة لتحفيز nsPEF عند 5 كيلو فولت و 10 كيلو فولت ، تليها الزراعة المستمرة لمدة 3-4 أيام. بعد ذلك ، تم تقييم بعض العوامل ذات الصلة التي عبرت عنها SCs لإثبات التحفيز الناجح ، بما في ذلك بروتين العلامة المحدد ، وعامل التغذية العصبية ، وعامل النسخ ، ومنظم الميالين. أظهرت النتائج التمثيلية أن nsPEF عزز بشكل كبير انتشار وهجرة SCs والقدرة على تجميع العوامل ذات الصلة التي تساهم بشكل إيجابي في تجديد الأعصاب الطرفية. في الوقت نفسه ، أشار التعبير المنخفض عن GFAP إلى التشخيص الحميد لإصابات الأعصاب الطرفية. تظهر كل هذه النتائج أن nsPEF لديه إمكانات كبيرة كطريقة علاج فعالة لإصابات الأعصاب الطرفية عن طريق تحفيز SCs.

Introduction

يتأثر ملايين الأشخاص كل عام بإصابات الأعصاب التي تشمل كلا من الجهاز العصبي المحيطي (PNS) والجهاز العصبي المركزي (CNS)1. أظهرت الدراسات أن قدرة الإصلاح المحوري للجهاز العصبي المركزي محدودة للغاية بعد إصابات الأعصاب ، بينما تظهر PNS قدرة معززة بسبب اللدونة الكبيرة ل SCs2. ومع ذلك ، فإن تحقيق التجديد الكامل بعد إصابات الأعصاب الطرفية لا يزال شاقا ولا يزال يشكل تحديا كبيرا لصحة الإنسان 3,4. في الوقت الحاضر ، ظلت الطعوم الذاتية علاجا شائعا على الرغم من عيوب اعتلال موقع المتبرع ومحدودية التوافر5. دفع هذا الموقف الباحثين إلى استكشاف علاجات بديلة ، بما في ذلك المواد6 والعوامل الجزيئية7 والتحفيز الكهربائي (ES). كعامل يعزز نمو المحور العصبي وتجديد الأعصاب8 ، يصبح اختيار طريقة مناسبة ل ES واستكشاف العلاقة بين ES و SCs أمرا ضروريا.

SCs هي الخلايا الدبقية الرئيسية في الجهاز العصبي الطرفي ، وتلعب دورا حاسما في تجديد PNS 9,10. بعد إصابات الأعصاب الطرفية ، تخضع SCs للتنشيط السريع ، وإعادة البرمجةالشاملة 2 ، والانتقال من حالة تكوين المايلين إلى مورفولوجيا داعمة للنمو لإجراء تجديد العصب2. يحدث انتشار كبير لل SCs في الطرف البعيد من العصب المصاب ، بينما تخضع SCs للجذع البعيد للتكاثر والاستطالة لتشكيل شريط Bungner ، وهو أمر ضروري لتوجيه المحاور العصبية للنمو نحو العضو المستهدف11. علاوة على ذلك ، تهاجر SCs من جذوع الأعصاب القريبة والبعيدة إلى الجسر العصبي لتشكيل حبال SC التي تعزز تجديد المحورالعصبي 12. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أن تخليق وإفراز العوامل ذات الصلة المتعلقة ب SCs يتغير في حالات تجديد الأعصاب الطرفية ، بما في ذلك عوامل النسخ13 ، وعوامل التغذية العصبية14 ، ومنظمات الميالين13. وهذا يوفر أيضا مؤشرات لتقييم نشاط الطوائف المنبوذة. وبناء على ذلك، تم التحقيق على نطاق واسع في تعزيز انتشار SC والهجرة والتوليف وإفراز العوامل ذات الصلة لتحسين تجديد الأعصاب الطرفية15.

أظهرت الدراسات السابقة إمكانية استخدام ES لتجديد الأعصاب1. التفسير المقبول على نطاق واسع هو أن ES يمكن أن يحفز إزالة استقطاب أغشية الخلايا ، ويغير إمكانات الغشاء ، ويؤثر على وظائف بروتين الغشاء عن طريق تغيير توزيعات الشحن على هذه الجزيئات الحيوية1. ومع ذلك ، فإن PEF المكثف المطبق على نطاق واسع قد يسبب ألما شديدا وتقلصات عضلية لا إرادية ورجفان القلب8. كما أنه يزيد من نشاط الكرياتين كيناز (CK) ، ويقلل من قوة العضلات ، ويحفز على تطور تأخر ظهور وجع العضلات (DOMS) 16. nsPEF هي تقنية ناشئة تحفز موضوعات الاختبار ذات المجالات الكهربائية عالية الجهد خلال مدة نبضة نانوثانية ، ويتم استخدامها تدريجيا في الأبحاث على المستوى الخلوي17,18. أفادت الدراسات السابقة أن الأساس المنطقي المحتمل ل nsPEF الذي يعزز تكاثر الخلايا ونشاط العضيات هو تكوين المسام النانوية الغشائية وتنشيط القنوات الأيونية ، مما يؤدي إلى زيادة تركيز السيتوبلازم Ca2+ 19. يستخدم nsPEF تقنية طاقة النبض لشحن غشاء الخلية ، وإنتاج نبضات تتميز بمدة قصيرة ، ووقت ارتفاع سريع ، وطاقة عالية ، وكثافة طاقة منخفضة20. تشير هذه الخصائص إلى أن nsPEF قد يكون وضعا مفضلا مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية للتحفيز8. علاوة على ذلك ، يوفر nsPEF مزايا مثل الإجراءات طفيفة التوغل ، وقابلية الانعكاس ، وقابلية الضبط ، وعدم التدمير للأنسجة العصبية مقارنة بالتدخلات الجراحية. أحد الاتجاهات البحثية السائدة ل nsPEF في المجال الطبي الحيوي هو تطبيقه لاستئصال أنسجة الورم باستخدام تحفيز المجال الكهربائي عالي الطاقة21،22،23. تشير بعض نتائج الأبحاث إلى أن 12-nsPEF يمكن أن يحفز الأعصاب الطرفية دون التسبب في ضرر24. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، هناك أدلة محدودة فيما يتعلق بتطبيق nsPEF في مجال تجديد الأعصاب. علاوة على ذلك ، فإن تحفيز SCs باستخدام nsPEF هو محاولة رائدة ، مما يساهم في مزيد من البحوث في الجسم الحي والسريري. تستكشف هذه الدراسة ما إذا كان تحفيز NSPEF ل SCs يمكن أن يعزز تجديد الأعصاب ويوفر أساسا موثوقا به للبحث المتعمق والمنهجي اللاحق.

Protocol

1. إذابة خلايا RSC96 المحفوظة بالتبريد قم بإذابة المبرد الذي يحتوي على 1 مل من معلق الخلية عن طريق رجه بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم أضفه إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 4-6 مل من وسط الاستزراع الكامل واخلطه جيدا. أجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 3-5 دقائق ، تخلص من …

Representative Results

تحفز المجالات الكهربائية النبضية منخفضة الكثافة تكاثر الخلاياوفقا لفحص CCK-8 ، كان معدل انتشار RSC96 في مجموعة 5 كيلو فولت / سم أسرع بكثير من خلايا المجموعة الضابطة. ومع ذلك، ومع زيادة البارامترات (20 كيلو فولت/سم و 40 كيلو فولت/سم)، كان معدل الانتشار غير مستقر، بل أقل من معدل الانتشار ف…

Discussion

في السنوات الأخيرة ، شهد تطبيق nsPEF تعزيز النمو ، كما ورد. nsPEF له تأثير مستهدف للغاية على المنطقة المرغوبة فقط ، حيث يوفر طاقة كافية للعلاج دون التسبب في أضرار حرارية إضافية ، مما يجعله أكثر أمانا لجسم الإنسان28. هذه الخصائص تعطيه آفاقا متعدية واعدة في علاج الأورام وتجديد الأعصاب…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المشروع الوطني لتطوير الأدوات والمعدات العلمية الرئيسية (رقم 82027803).

Materials

Antifade mounting medium Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1401
Anti-GFAP Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB14146-100
BSA Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GC305010
Coverslip Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD 10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB21302
DAPI Staining Reagent Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1012
Decolorizing shaker Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF Matsusada Precision Inc. AU-60P1.6-L
Histochemical pen Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G6100
Membrane breaking liquid Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1204
Microscope slide Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G6012
Palm centrifuge Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD MS6000
PBS powdered Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G0002
Pipette Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope Nikon, Japan NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD STCC30007G-1
scanister 3DHISTECH Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF Times Microwave Systems M17/78-RG217
Turbine mixer Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD MV-100

References

  1. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
  2. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).
  3. Aguilar, Z. . Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).
  4. Xie, S., et al. Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions. Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).
  5. Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration. J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).
  6. Daly, W. T., et al. Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair. Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).
  7. Lee, B. -. K., et al. End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration. Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).
  8. Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers. Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).
  9. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
  10. Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).
  11. Yi, S., et al. Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury. J Cell Sci. 132 (6), (2019).
  12. Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge. Glia. 69 (2), 235-254 (2021).
  13. Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. Transcriptional control of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).
  14. Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons. Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).
  15. Gu, Y., et al. miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR. PLoS One. 10 (12), e0145185 (2015).
  16. Dong, H. -. L., et al. AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).
  17. Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms. Physiol Meas. 25 (4), 1077 (2004).
  18. Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing. Biotechnol Adv. 53, 107780 (2021).
  19. Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora’s box. Int J Mol Sci. 23 (11), 6158 (2022).
  20. Nuccitelli, R., et al. First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method. Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).
  21. Nuccitelli, R., et al. Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).
  22. Carr, L., et al. A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model. Bioelectrochemistry. 141, 107839 (2021).
  23. Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation. Sci Rep. 10 (1), 5122 (2020).
  24. Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Exp Neurol. 332, 113397 (2020).
  25. Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -. L., Moore, A. M. The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury. Biomolecules. 12 (12), 1856 (2022).
  26. Jessen, K. R., Mirsky, R. Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease. Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).
  27. Chen, Z. -. L., Yu, W. -. M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  28. Yin, D., et al. Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF). PloS One. 7 (8), e43891 (2012).
  29. Qi, F., et al. Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth. Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).
  30. Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro. Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).
  31. Ho, T. -. C., et al. Hydrogels: Properties and applications in biomedicine. Molecules. 27 (9), 2902 (2022).

Play Video

Cite This Article
Han, J., Wang, Z., Dong, Y., Zou, X., Wang, H., Chen, Y., Abdalbary, S. A., Tu, T., Lu, H. Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro. J. Vis. Exp. (207), e66097, doi:10.3791/66097 (2024).

View Video