JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

İn Vitro Periferik Sinir Rejenerasyonu için Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı ile Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi

Published: May 03, 2024
doi:
10.3791/66097
, , , , , , , ,
1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, College of Medicine,Zhejiang University, 2College of Medicine,Zhejiang University, 3Department of Orthopedics,The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 4Department of Orthopedic Physical Therapy, Faculty of Physical Therapy,Nahda University in Beni Suef, 5Plastic & Cosmetic Center, The First Affiliated Hospital, College of Medicine,Zhejiang University

Summary

Burada, Schwann hücrelerini in vitro olarak uyarmak için nanosaniye darbeli elektrik alanı (nsPEF) uygulamak için bir protokol sunuyoruz. İlgili faktörlerin ve hücre davranışı değişikliklerinin sentezi ve salgılanma yeteneği, nsPOF kullanılarak başarılı stimülasyonu doğruladı. Çalışma, periferik sinir rejenerasyon yönteminin olumlu bir görünümünü vermektedir.

Abstract

Schwann hücreleri (SK’ler), periferik sinir sisteminin miyelinli hücreleridir ve periferik sinir rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynarlar. Nanosaniye Darbe Elektrik Alanı (nsPEF), hücre proliferasyonunu ve diğer biyolojik süreçleri uyarmada etkili olduğu gösterilmiş, sinir elektriksel stimülasyonunda uygulanabilir yeni ortaya çıkan bir yöntemdir. SK’lerin nsPEF altında önemli değişikliklere uğrayıp uğramadığını değerlendirmek ve yeni periferik sinir rejenerasyon yöntemlerinin potansiyelini keşfetmeye yardımcı olmak amacıyla, kültürlenmiş RSC96 hücreleri 5 kV ve 10 kV’de nsPEF stimülasyonuna tabi tutuldu ve ardından 3-4 gün boyunca ekintiye devam edildi. Daha sonra, spesifik belirteç proteini, nörotrofik faktör, transkripsiyon faktörü ve miyelinasyon regülatörü dahil olmak üzere başarılı stimülasyonu göstermek için SK’ler tarafından ifade edilen bazı ilgili faktörler değerlendirildi. Temsili sonuçlar, nsPEF’in SK’lerin proliferasyonunu ve göçünü ve periferik sinirlerin rejenerasyonuna olumlu katkıda bulunan ilgili faktörleri sentezleme yeteneğini önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Aynı zamanda, GFAP’ın daha düşük ekspresyonu periferik sinir yaralanmalarının benign prognozunu gösterdi. Tüm bu sonuçlar, nsPEF’in SK’leri uyararak periferik sinir yaralanmaları için etkili bir tedavi yöntemi olarak büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Introduction

Her yıl milyonlarca insan hem periferik sinir sistemini (PNS) hem de merkezi sinir sistemini (CNS) içeren sinir yaralanmalarından etkilenmektedir1. Çalışmalar, sinir yaralanmalarından sonra CNS’nin aksonal onarım kapasitesinin oldukça sınırlı olduğunu, PNS’nin ise SC’lerin2’nin önemli plastisitesi nedeniyle artmış kapasite gösterdiğini göstermiştir. Bununla birlikte, periferik sinir yaralanmalarından sonra tam rejenerasyonun sağlanması zorlu olmaya devam etmekte ve insan sağlığı için önemli bir zorluk teşkil etmeye devam etmektedir 3,4. Günümüzde, otogreftler, donör bölge morbiditesinin dezavantajlarına ve sınırlı kullanılabilirliğe rağmen yaygın bir tedavi olmaya devam etmektedir5. Bu durum, araştırmacıları malzeme6, moleküler faktörler7 ve elektriksel stimülasyon (ES) dahil olmak üzere alternatif tedavileri keşfetmeye sevk etti. Aksonal büyümeyi ve sinir rejenerasyonunuteşvik eden bir faktör olarak8, uygun bir ES yönteminin seçilmesi ve ES ile SK’ler arasındaki ilişkinin araştırılması zorunlu hale gelmektedir.

SK’ler, PNS’nin ana glial hücreleridir ve PNS 9,10’un rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynar. Periferik sinir yaralanmalarını takiben, SK’ler hızlı aktivasyona, kapsamlı yeniden programlamaya2 ve sinirinrejenerasyonunu gerçekleştirmek için miyelin oluşturan bir durumdan büyümeyi destekleyici bir morfolojiye geçiş yapar 2. Yaralı sinirin distal ucunda önemli bir SK proliferasyonu meydana gelirken, distal güdük SK’leri, aksonların hedef organa doğru büyümesine rehberlik etmek için gerekli olan Bungner bandını oluşturmak için proliferasyon ve uzamaya uğrar11. Ayrıca, proksimal ve distal sinir güdüklerinden gelen SK’ler, akson rejenerasyonunu destekleyen SC kordonları oluşturmak için sinir köprüsüne göç eder12. Ayrıca, önceki çalışmalar, transkriptiyonel faktörler 13, nörotrofik faktörler14 ve miyelinasyon düzenleyicileri13 dahil olmak üzere periferik sinir rejenerasyonu vakalarında SK’lerle ilgili ilgili faktörlerin sentezi ve sekresyonunundeğiştiğini göstermiştir. Bu aynı zamanda SK’lerin aktivitesini değerlendirmek için göstergeler sağlar. Bunlara dayanarak, periferik sinir rejenerasyonunu iyileştirmek için SK proliferasyonunun, migrasyonunun, sentezinin ve ilgili faktörlerin salgılanmasının teşvik edilmesi kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır15.

Önceki çalışmalar, sinir rejenerasyonu için ES’nin kullanılma olasılığını göstermiştir1. Yaygın olarak kabul edilen bir açıklama, ES’nin hücre zarlarının depolarizasyonunu indükleyebileceği, zar potansiyelini değiştirebileceği ve bu biyomoleküller üzerindeki yük dağılımlarını değiştirerek zar protein fonksiyonlarını etkileyebileceğidir1. Bununla birlikte, yaygın olarak uygulanan Yoğun PEF şiddetli ağrıya, istemsiz kas kasılmalarına ve kalp fibrilasyonuna neden olabilir8. Aynı zamanda kreatin kinaz (CK) aktivitesini arttırır, kas gücünü azaltır ve gecikmiş başlangıçlı kas ağrısı (DOMS) gelişimini indükler16. nsPEF, nanosaniye darbe süresi içinde yüksek voltajlı elektrik alanlarına sahip test deneklerini uyaran gelişmekte olan bir tekniktir ve hücresel düzeydeki araştırmalarda kademeli olarak kullanılmaktadır17,18. Önceki çalışmalar, hücre proliferasyonunu ve organel aktivitesini teşvik eden nsPEF’in olası mantığının, zar nanogözeneklerinin oluşumu ve iyonik kanalların aktivasyonu olduğunu ve bunun da sitoplazmikCa2+ konsantrasyonunda bir artışa yol açtığınıbildirmiştir 19. nsPEF, hücre zarını şarj etmek için darbe gücü teknolojisini kullanır ve kısa süre, hızlı yükselme süresi, yüksek güç ve düşük enerji yoğunluğu20 ile karakterize edilen darbeler üretir. Bu özellikler, nsPEF’in minimum stimülasyon yan etkileri ile tercih edilen bir mod olabileceğini düşündürmektedir8. Ayrıca nsPEF, cerrahi girişimlere göre minimal invaziv işlemler, geri dönüşümlülük, ayarlanabilirlik ve nöral dokulara tahribatsızlık gibi avantajlar sunmaktadır. nsPEF’in biyomedikal alandaki ana araştırma yönlerinden biri, yüksek enerjili elektrik alan stimülasyonu 21,22,23 kullanılarak tümör dokusu ablasyonu için uygulanmasıdır. Bazı araştırma sonuçları, 12-nsPEF’in periferik sinirleri hasara neden olmadan uyarabildiğini göstermektedir24. Bununla birlikte, şu anda, sinir rejenerasyonu alanında nsPEF’in uygulanmasına ilişkin sınırlı kanıt bulunmaktadır. Ayrıca, nsPEF kullanarak SK’leri uyarmak, in vivo ve klinik araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunan öncü bir girişimdir. Bu çalışma, SK’lerin nsPEF stimülasyonunun sinir rejenerasyonunu teşvik edip edemeyeceğini ve sonraki derinlemesine ve sistematik araştırmalar için güvenilir bir temel sağlayıp sağlayamayacağını araştırmaktadır.

Protocol

1. Dondurularak saklanmış RSC96 hücrelerinin çözülmesi 1 mL hücre süspansiyonu içeren kriyoviyalı 37 °C’lik bir su banyosunda hızla çalkalayarak çözün ve ardından 4-6 mL tam kültür ortamı içeren bir santrifüj tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın. 3-5 dakika boyunca 1000 x g’da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 3 mL tam kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 6-8 mL tam kültür ortamı içeren bir…

Representative Results

Düşük yoğunluklu darbeli elektrik alanları hücre proliferasyonunu uyarırCCK-8 testine göre, 5 kV / cm grubundaki RSC96’nın proliferasyon hızı, kontrol grubu hücrelerinden önemli ölçüde daha hızlıydı. Bununla birlikte, parametreler arttıkça (20 kV/cm ve 40 kV/cm), proliferasyon hızı kararsızdı, hatta kontrol grubununkinden bile daha düşüktü. RSC96 hücrelerinin hücre proliferasyon hızı, 40 kV/cm grubunda, kontrol ve 5 kV/cm gruplarından anlamlı derecede düşüktü ve…

Discussion

Son yıllarda, bildirildiği gibi, nsPEF uygulaması artan bir büyüme yaşadı. nsPEF, yalnızca istenen alan üzerinde yüksek oranda hedeflenmiş bir etkiye sahiptir, ek termal hasara neden olmadan tedavi etmek için yeterli enerji sağlar ve insan vücudu için daha güvenli hale getirir28. Bu özellikler, tümör tedavisinde ve sinir rejenerasyonunda umut verici translasyonel beklentiler sağlar. Bununla birlikte, bazı çalışmalar nsPEF’in bazı sınırlamalarını önermiştir. Malzeme a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Anahtar Bilimsel Araç ve Ekipman Geliştirme Projesi (NO.82027803) tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Antifade mounting medium Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1401
Anti-GFAP Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB14146-100
BSA Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GC305010
Coverslip Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD 10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB21302
DAPI Staining Reagent Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1012
Decolorizing shaker Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF Matsusada Precision Inc. AU-60P1.6-L
Histochemical pen Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G6100
Membrane breaking liquid Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1204
Microscope slide Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G6012
Palm centrifuge Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD MS6000
PBS powdered Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G0002
Pipette Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope Nikon, Japan NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD STCC30007G-1
scanister 3DHISTECH Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF Times Microwave Systems M17/78-RG217
Turbine mixer Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD MV-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
  2. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).
  3. Aguilar, Z. . Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).
  4. Xie, S., et al. Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions. Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).
  5. Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration. J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).
  6. Daly, W. T., et al. Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair. Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).
  7. Lee, B. -. K., et al. End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration. Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).
  8. Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers. Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).
  9. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
  10. Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).
  11. Yi, S., et al. Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury. J Cell Sci. 132 (6), (2019).
  12. Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge. Glia. 69 (2), 235-254 (2021).
  13. Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. Transcriptional control of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).
  14. Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons. Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).
  15. Gu, Y., et al. miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR. PLoS One. 10 (12), e0145185 (2015).
  16. Dong, H. -. L., et al. AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).
  17. Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms. Physiol Meas. 25 (4), 1077 (2004).
  18. Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing. Biotechnol Adv. 53, 107780 (2021).
  19. Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora’s box. Int J Mol Sci. 23 (11), 6158 (2022).
  20. Nuccitelli, R., et al. First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method. Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).
  21. Nuccitelli, R., et al. Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).
  22. Carr, L., et al. A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model. Bioelectrochemistry. 141, 107839 (2021).
  23. Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation. Sci Rep. 10 (1), 5122 (2020).
  24. Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Exp Neurol. 332, 113397 (2020).
  25. Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -. L., Moore, A. M. The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury. Biomolecules. 12 (12), 1856 (2022).
  26. Jessen, K. R., Mirsky, R. Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease. Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).
  27. Chen, Z. -. L., Yu, W. -. M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  28. Yin, D., et al. Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF). PloS One. 7 (8), e43891 (2012).
  29. Qi, F., et al. Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth. Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).
  30. Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro. Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).
  31. Ho, T. -. C., et al. Hydrogels: Properties and applications in biomedicine. Molecules. 27 (9), 2902 (2022).

Tags

Schwann CellsNanosecond Pulsed Electric FieldNsPEFPeripheral Nerve RegenerationCell ProliferationCell MigrationNeurotrophic FactorsMyelination RegulatorsGFAP

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Han, J., Wang, Z., Dong, Y., Zou, X., Wang, H., Chen, Y., Abdalbary, S. A., Tu, T., Lu, H. Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro. J. Vis. Exp. (207), e66097, doi:10.3791/66097 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image