Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

La inmunofluorescencia es una técnica fundamental de la biología celular moderna desarrollada originalmente por Albert Coons, que permite la detección de moléculas en sus compartimentos celulares nativos y la caracterización de las composiciones moleculares de orgánulos o maquinarias subcelulares¹. Junto con las manipulaciones genéticas, la inmunofluorescencia ayuda a establecer el concepto ahora bien aceptado de que la localización de proteínas es esencial para^{su función.} Aparte de los anticuerpos primarios específicos y los colorantes fluorescentes brillantes, el éxito de esta técnica se basa en un proceso preliminar llamado fijación y permeabilización, que preserva las morfologías celulares, inmoviliza los antígenos y aumenta la accesibilidad de los anticuerpos a los compartimentos intracelulares. Inevitablemente, el proceso de fijación y permeabilización mataría a las células y terminaría con todos los procesos biológicos³. Por lo tanto, la inmunofluorescencia solo proporciona instantáneas del viaje de la vida de las proteínas. Sin embargo, muchos procesos biológicos, como la migración y la división celular, son de naturaleza dinámica, lo que requiere la investigación del comportamiento de las proteínas de una manera resuelta espacio-temporalmente ^4,5.

Para examinar la dinámica de las proteínas en los organismos vivos, se han desarrollado métodos de imagen en vivo basados en proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, como la proteína fluorescente verde (GFP)⁶ y microscopios confocales de alta velocidad. Brevemente, la proteína de interés puede ser manipulada genéticamente para ser fusionada con GFP⁷, y luego expresada ectópicamente a partir de promotores virales o de levaduras como el citomegalovirus (CMV)⁸ o la secuencia de activación ascendente (UAS)⁹. Debido a que la GFP es de naturaleza autofluorescente, no se requieren anticuerpos acoplados a fluoróforos para revelar la localización de las proteínas diana, lo que evita la necesidad de procesos preliminares de fijación o permeabilización. A lo largo de las últimas dos décadas, se han desarrollado etiquetas fluorescentes que abarcan todo el espectro de longitudes de onda¹⁰, lo que permite obtener imágenes en vivo multicolor de varias proteínas diana al mismo tiempo. Sin embargo, en comparación con los colorantes fluorescentes de ingeniería química como AlexaFluor o ATTO, la autofluorescencia de estas proteínas fluorescentes codificadas genéticamente es relativamente débil e inestable cuando se expresa a partir de promotores endógenos, especialmente durante la obtención de imágenes en vivo en escalas de tiempo más largas¹⁰. Si bien este déficit puede mitigarse mediante la sobreexpresión de proteínas diana marcadas con fluorescencia, muchas con actividades enzimáticas como quinasas y fosfatasas interrumpen gravemente los procesos biológicos normales si no se expresan a niveles fisiológicos.

Este protocolo presenta un método que permite la iluminación de dianas basada en anticuerpos fotoestables en una configuración de imagen en vivo, lo que esencialmente permite la inmunofluorescencia sin el proceso de fijación o permeabilización (Figura 1). A través de una simple reacción de amina primaria basada en NHS¹¹, se pueden conjugar colorantes fluorescentes como AlexaFluor 488 o 594 con esencialmente cualquier anticuerpo primario o GFP/HA/Myc^{nanobody 12}. Aprovechando una característica del desarrollo de que todas las células embrionarias de Drosophila comparten un citoplasma común durante la etapa¹³ de sincitio, se puede lograr la unión al antígeno y la iluminación en embriones enteros después de la inyección de anticuerpos conjugados con colorante. Con la expansión de las bibliotecas de proteínas marcadas endógenamente disponibles en Drosophila y otros sistemas modelo¹⁴, este método puede ampliar potencialmente las aplicaciones de estas bibliotecas al revelar la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia de baja abundancia y otras proteínas marcadas con fluorescencia (marcadas con HA/Myc) en tejidos vivos.