Summary

Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la marcatura e l’iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l’imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Abstract

La visualizzazione delle proteine nelle cellule viventi utilizzando GFP (Green Fluorescent Protein) e altri tag fluorescenti ha notevolmente migliorato la comprensione della localizzazione, della dinamica e della funzione delle proteine. Rispetto all’immunofluorescenza, l’imaging dal vivo riflette in modo più accurato la localizzazione delle proteine senza potenziali artefatti derivanti dalla fissazione dei tessuti. È importante sottolineare che l’imaging dal vivo consente la caratterizzazione quantitativa e temporale dei livelli e della localizzazione delle proteine, fondamentali per la comprensione di processi biologici dinamici come il movimento o la divisione cellulare. Tuttavia, una delle principali limitazioni degli approcci di marcatura fluorescente è la necessità di livelli di espressione proteica sufficientemente elevati per ottenere una visualizzazione di successo. Di conseguenza, molte proteine fluorescenti marcate endogenamente con livelli di espressione relativamente bassi non possono essere rilevate. D’altra parte, l’espressione ectopica mediante promotori virali può talvolta portare a una dislocalizzazione delle proteine o ad alterazioni funzionali in contesti fisiologici. Per affrontare queste limitazioni, viene presentato un approccio che utilizza la rilevazione di proteine mediate da anticorpi altamente sensibili negli embrioni viventi, essenzialmente eseguendo l’immunofluorescenza senza la necessità di fissazione tissutale. Come prova di principio, il recettore Notch marcato endogenamente con GFP, che è appena rilevabile negli embrioni viventi, può essere visualizzato con successo dopo l’iniezione di anticorpi. Inoltre, questo approccio è stato adattato per visualizzare le modificazioni post-traduzionali (PTM) negli embrioni viventi, consentendo di rilevare cambiamenti temporali nei modelli di fosforilazione della tirosina durante l’embriogenesi precoce e rivelando una nuova sottopopolazione di fosfotirosina (p-Tyr) sotto le membrane apicali. Questo approccio può essere modificato per adattarsi ad altri anticorpi proteina-specifici, tag-specifici o PTM-specifici e dovrebbe essere compatibile con altri organismi modello o linee cellulari suscettibili di iniezione. Questo protocollo apre nuove possibilità per l’imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o PTM che in precedenza erano difficili da rilevare con i tradizionali metodi di marcatura fluorescente.

Introduction

L’immunofluorescenza è una tecnica fondamentale della moderna biologia cellulare originariamente sviluppata da Albert Coons, che consente la rilevazione di molecole nei loro compartimenti cellulari nativi e la caratterizzazione delle composizioni molecolari di organelli subcellulari o macchinari1. Insieme alle manipolazioni genetiche, l’immunofluorescenza aiuta a stabilire il concetto, ormai ben accettato, che la localizzazione delle proteine è essenziale per la sua funzione2. A parte gli anticorpi primari specifici e i coloranti fluorescenti brillanti, il successo di questa tecnica si basa su un processo preliminare chiamato fissazione e permeabilizzazione, che preserva le morfologie cellulari, immobilizza gli antigeni e aumenta l’accessibilità degli anticorpi nei compartimenti intracellulari. Inevitabilmente, il processo di fissazione e permeabilizzazione ucciderebbe le cellule e porrebbe fine a tutti i processi biologici3. Pertanto, l’immunofluorescenza fornisce solo istantanee del percorso di vita delle proteine. Tuttavia, molti processi biologici come la migrazione e le divisioni cellulari sono di natura dinamica e richiedono lo studio dei comportamenti delle proteine in modo spazio-temporalmente risolto 4,5.

Per esaminare la dinamica delle proteine negli organismi viventi, sono stati sviluppati metodi di imaging dal vivo basati su proteine fluorescenti geneticamente codificate come la proteina fluorescente verde (GFP)6 e microscopi confocali ad alta velocità. In breve, la proteina di interesse può essere manipolata geneticamente per essere fusa con GFP7 e quindi espressa ectopicamente da promotori virali o di lievito come il citomegalovirus (CMV)8 o la sequenza di attivazione a monte (UAS)9. Poiché la GFP è di natura autofluorescente, non sono necessari anticorpi accoppiati a fluorofori per rivelare la localizzazione delle proteine bersaglio, il che bypassa la necessità di processi preliminari di fissazione o permeabilizzazione. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati tag fluorescenti che coprono l’intero spettro della lunghezza d’onda10, consentendo l’imaging dal vivo multicolore di diverse proteine bersaglio contemporaneamente. Tuttavia, rispetto ai coloranti fluorescenti ingegnerizzati chimicamente come AlexaFluor o ATTO, l’autofluorescenza di queste proteine fluorescenti geneticamente codificate è relativamente debole e instabile quando espressa da promotori endogeni, specialmente durante l’imaging dal vivo su scale temporali più lunghe10. Mentre questa carenza può essere mitigata sovraesprimendo proteine bersaglio marcate con fluorescenza, molte con attività enzimatiche come chinasi e fosfatasi interrompono gravemente i normali processi biologici se non espresse a livelli fisiologici.

Questo protocollo presenta un metodo che consente l’illuminazione del bersaglio basata su anticorpi fotostabili in una configurazione di immagine dal vivo, consentendo essenzialmente l’immunofluorescenza senza il processo di fissazione o permeabilizzazione (Figura 1). Attraverso una semplice reazione amminica primaria basata su NHS11, è possibile coniugare coloranti fluorescenti come AlexaFluor 488 o 594 con essenzialmente qualsiasi anticorpo primario o GFP/HA/Myc nanobody12. Sfruttando una caratteristica di sviluppo che tutte le cellule embrionali di Drosophila condividono un citoplasma comune durante lo stadio13 del sincizio, è possibile ottenere il legame dell’antigene e l’illuminazione in interi embrioni dopo l’iniezione di anticorpi coniugati con coloranti. Con l’espansione delle librerie di proteine marcate endogenamente disponibili in Drosophila e in altri sistemi modello14, questo metodo può potenzialmente ampliare le applicazioni di queste librerie rivelando le dinamiche di proteine marcate fluorescenti a bassa abbondanza e di altre proteine marcate in modo fluorescente (HA/Myc-tagged) nei tessuti viventi.

Protocol

Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida e l’approvazione della School of Life Sciences dell’Università SUSTech. L’organismo utilizzato è Drosophila melanogaster, e i genotipi sono Notch-Knockin-GFP (Cromosoma X) e Sqh-sqh-GFP (Cromosoma II), generosamente forniti rispettivamente dai laboratori del Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) e della Dr.ssa Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sugli aspetti della marcatu…

Representative Results

Per dimostrare i vantaggi del metodo di iniezione degli anticorpi rispetto all’imaging dal vivo basato su tag fluorescenti o all’immunofluorescenza, vengono forniti due casi di studio che caratterizzano la localizzazione dinamica di un recettore transmembrana a bassa abbondanza, Notch, e un tipo di modificazione post-traduzionale chiamata fosforilazione della tirosina negli embrioni viventi. L’attività di segnalazione di Notch svolge un ruolo importante nella determinazione del destino cellul…

Discussion

Questa procedura presentata delinea il metodo specializzato di marcatura a fluorescenza con anticorpi personalizzati e successiva iniezione in embrioni di Drosophila in fase iniziale. Questa tecnica facilita la visualizzazione in tempo reale di proteine o modificazioni post-traduzionali che esistono in piccole quantità e sono in genere difficili da osservare attraverso i metodi convenzionali di marcatura GFP/mCherry.

Occorre prestare attenzione quando si estende questo metodo per eff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Jennifer A. Zallen per aver fornito la linea Sqh-GFP Drosophila e il supporto per lo sviluppo iniziale di questa tecnica, e il Dr. Francois Schweisguth per aver fornito la linea Notch-GFP Drosophila . Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Natural Science Foundation of China (32270809) a H.H.Yu, generoso sostegno finanziario e personale da parte della School of Life Sciences, SUSTech, e da finanziamenti a Y. Yan da parte della Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.

Materials

Agarose Sangon Biotech  A620014 
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit Invitrogen  A20185 Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope SOPTOP EX20 Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-4
Centrifuge Eppendorf 5245
Cell Strainer FALCON 352350
Desiccation chamber  LOCK&LOCK HSM8200 320ml
Dissecting Microscope Mshot MZ62 Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape Scotch 665
Fine Super Tweezer VETUS ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Forcep VETUS 33A-SA
Halocarbon oil 27 Sigma-Aldrich H8773-100ML
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-100ML
Heptane Sigma-Aldrich H2198-1L Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent  TOKAI 1-7315-01 Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller World Precision Instruments PUL-1000 Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50.
Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 
Pneumatic picopump World Precision Instruments PV 830 Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20 Santa Cruz SC-508
Square petri dishes Biosharp BS-100-SD
GFP nanobody Chromotek gt

References

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Zheng, Q., Xiang, X., Yan, Y., Yu, H. H. Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection. J. Vis. Exp. (203), e66080, doi:10.3791/66080 (2024).

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