蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

免疫蛍光法は、アルバート・クーンズによって最初に開発された現代細胞生物学の基礎技術であり、天然の細胞区画で分子を検出し、細胞内オルガネラまたは^{機械の分子}組成の特性評価を可能にします1。遺伝子操作と相まって、免疫蛍光法は、タンパク質の局在化が^{その機能に}不可欠であるという、現在広く受け入れられている概念の確立に役立ちます2。この技術の成功は、特異的な一次抗体と明るい蛍光色素の他に、細胞形態を維持し、抗原を固定化し、細胞内コンパートメントへの抗体のアクセス性を高める固定および透過化という予備プロセスに依存しています。必然的に、固定と透過のプロセスは細胞を殺し、すべての^{生物学的プロセスを終了}させます3。したがって、免疫蛍光法は、タンパク質のライフジャーニーのスナップショットを提供するだけです。しかし、細胞の遊走や分裂などの多くの生物学的プロセスは本質的に動的であり、時空間的に分解された方法でタンパク質の挙動を調べる必要があります^4,5。

生体内の蛋白質動態を調べるために、緑色蛍光蛋白質(GFP)⁶ などの遺伝子にコードされた蛍光蛋白質を用いたライブイメージング法や高速共焦点顕微鏡が開発されています。簡単に説明すると、目的のタンパク質を遺伝子操作してGFP⁷と融合させ、サイトメガロウイルス(CMV)⁸ や上流活性化配列(UAS)⁹などのウイルスまたは酵母のプロモーターから異所的に発現させることができます。GFPは本質的に自家蛍光であるため、標的タンパク質の局在を明らかにするために蛍光色素結合抗体は必要なく、固定または透過処理の予備プロセスの必要性を回避します。過去20年間で、波長の全スペクトルにわたる蛍光タグが開発され¹⁰、複数の標的タンパク質のマルチカラーライブイメージングを同時に可能にしました。しかし、AlexaFluorやATTOなどの化学的に操作された蛍光色素と比較して、これらの遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の自家蛍光は、内因性プロモーターから発現する場合、特により長い時間スケールにわたるライブイメージング中に、比較的弱く不安定である¹⁰。この不足は、蛍光タグ付き標的タンパク質を過剰発現させることで軽減できますが、キナーゼやホスファターゼなどの酵素活性を持つ多くは、生理学的レベルで発現しない場合、正常な生物学的プロセスを著しく破壊します。

このプロトコルは、ライブ画像セットアップで光安定性抗体ベースのターゲット照明を可能にする方法を示しており、固定または透過処理のプロセスなしで本質的に免疫蛍光を可能にします(図1)。単純なNHSベースの第一級アミン反応¹¹により、AlexaFluor 488や594などの蛍光色素を、基本的に任意の一次抗体またはGFP/HA/Mycナノボディ¹²と結合させることができます。ショウ ジョウバエ の胚細胞は合胞体期¹³で共通の細胞質を共有するという発生上の特徴を利用して、色素標識抗体の注入後、胚全体にわたる抗原結合と照明を達成することができます。ショウ ジョウバエ やその他のモデル系で利用可能な内因性タグ付きタンパク質のライブラリが拡大しているため¹⁴、この方法は、生体組織における少量の蛍光タグ付きタンパク質およびその他の非蛍光タグ付き(HA / Mycタグ付き)タンパク質のダイナミクスを明らかにすることにより、これらのライブラリのアプリケーションを潜在的に広げることができます。