Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител

Иммунофлуоресценция является краеугольным камнем современной клеточной биологии, первоначально разработанным Альбертом Кунсом, который позволяет обнаруживать молекулы в их собственных клеточных компартментах и характеризовать молекулярный состав субклеточных органелл или^{механизмов.} В сочетании с генетическими манипуляциями иммунофлуоресценция помогает установить общепринятую концепцию о том, что локализация белка имеет важное значение для^{его функционирования.} Помимо специфических первичных антител и ярких флуоресцентных красителей, успех этого метода основан на предварительном процессе, называемом фиксацией и пермеабилизацией, который сохраняет клеточную морфологию, иммобилизует антигены и увеличивает доступ антител во внутриклеточные компартменты. Процесс фиксации и пермеабилизации неизбежно убьет клетки и завершит все биологические^{процессы.} Таким образом, иммунофлуоресценция дает только моментальные снимки жизненного пути белков. Однако многие биологические процессы, такие как миграция и деление клеток, являются динамическими по своей природе, что требует исследования поведения белков в пространственно-временном ^{разрешении.}

Для изучения динамики белков в живых организмах были разработаны методы визуализации в реальном времени, основанные на генетически кодируемых флуоресцентных белках, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP)⁶ и высокоскоростные конфокальные микроскопы. Вкратце, интересующий нас белок может быть генетически модифицирован для слияния с GFP⁷, а затем эктопически экспрессирован из вирусных или дрожжевых промоторов, таких как цитомегаловирус (ЦМВ)⁸ или восходящая последовательность активации (UAS)⁹. Поскольку GFP является автофлуоресцентным по своей природе, для выявления локализации белков-мишеней не требуется никаких флуорофорных антител, что позволяет избежать необходимости предварительных процессов фиксации или пермеабилизации. За последние два десятилетия были разработаны флуоресцентные метки, охватывающие весь спектр длин^волн10, что позволяет получать многоцветную живую визуализацию нескольких белков-мишеней одновременно. Однако, по сравнению с химически модифицированными флуоресцентными красителями, такими как AlexaFluor или ATTO, автофлуоресценция этих генетически кодируемых флуоресцентных белков относительно слаба и нестабильна при экспрессии от эндогенных промоторов, особенно во время визуализации в реальном времени в более длительных^{временных} масштабах. Хотя этот недостаток может быть смягчен чрезмерной экспрессией флуоресцентно меченных белков-мишеней, многие из них с ферментативной активностью, такой как киназы и фосфатазы, серьезно нарушают нормальные биологические процессы, если не экспрессируются на физиологическом уровне.

Этот протокол представляет собой метод, который позволяет подсвечивать мишень на основе фотостабильных антител в режиме реального времени, по сути, обеспечивая иммунофлуоресценцию без процесса фиксации или пермеабилизации (рис. 1). С помощью простой первичной аминовой реакции¹¹ на основе NHS можно конъюгировать флуоресцентные красители, такие как AlexaFluor 488 или 594, практически с любым первичным антителом или GFP/HA/Myc nanobody¹². Используя особенность развития, заключающуюся в том, что все эмбриональные клетки дрозофилы имеют общую цитоплазму во время^13-й стадии синцития, можно добиться связывания антигена и освещения целых эмбрионов после инъекции антител, конъюгированных с красителем. С расширением библиотек эндогенно меченых белков, доступных в дрозофиле и других модельных системах¹⁴, этот метод потенциально может расширить применение этих библиотек, выявляя динамику флуоресцентно меченных белков с низким содержанием и других нефлуоресцентно меченных белков (HA/Myc-меченых) в живых тканях.