Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.
A tecnologia de edição do genoma é amplamente utilizada para produzir animais geneticamente modificados, incluindo ratos. A injeção citoplasmática ou pronuclear de moldes de reparo de DNA e reagentes CRISPR-Cas é o método de liberação mais comum em embriões. No entanto, esse tipo de micromanipulação requer acesso a equipamentos especializados, é trabalhoso e requer um certo nível de habilidade técnica. Além disso, as técnicas de microinjeção frequentemente resultam em menor sobrevivência do embrião devido ao estresse mecânico sobre o embrião. Neste protocolo, desenvolvemos um método otimizado para entregar grandes modelos de reparo de DNA para trabalhar em conjunto com a edição do genoma CRISPR-Cas9 sem a necessidade de microinjeção. Este protocolo combina a entrega de DNA mediada por AAV de modelos de doadores de DNA de fita simples juntamente com a entrega de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) por eletroporação para modificar embriões de 2 células. Usando esta nova estratégia, produzimos com sucesso modelos de ratos knock-in direcionados carregando a inserção de sequências de DNA de 1,2 a 3,0 kb de tamanho com eficiências entre 42% e 90%.
O desenvolvimento de ferramentas de edição do genoma baseadas em CRISPR acelerou nossa capacidade de gerar eficientemente novos e mais sofisticados modelos de ratos geneticamente modificados. O RNA guia-único, juntamente com a nuclease Cas9, é combinado para formar complexos de ribonucleoproteína (RNP) que têm como alvo sequências de DNA de interesse dentro do genoma e resultam em quebras de DNA de fita dupla. Como os mecanismos de reparo do DNA celular são propensos a erros, inserções e deleções (INDELs) são introduzidas durante o processo de reparo que podem interromper a função de um gene alvo. Quando há co-entrega de uma sequência de DNA projetada desejada (modelo de reparo) juntamente com reagentes de edição do genoma, a inserção do molde de reparo na região que contém a quebra de DNA de fita dupla ocorre por meio de um processo chamado reparo dirigido por homologia (HDR). Esta é uma estratégia eficaz para gerar modelos animais com inserções/substituições de DNA direcionadas (knock-ins). Uma limitação é que as sequências knock-in são frequentemente grandes em tamanho, o que demonstrou reduzir a eficiência da edição gênica, tornando a geração do modelo desejado mais difícil1. Estratégias para aumentar a eficiência do knock-in incluíram a linearização de modelos de reparo de DNA de fita dupla (dsDNA) e DNA de fita simples (ssDNA) e modificação química de modelos de reparo de DNA 2,3,4. Além disso, a microinjeção pronuclear juntamente com compostos estimuladores de HDR, a aplicação de pulsos elétricos em conjunto com a microinjeção e a microinjeção cronometrada em embriões de 2 células têm sido tentadas 5,6,7. Apesar do sucesso de algumas dessas abordagens, a incorporação de sequências de DNA maiores que 1,0 kb permanece tecnicamente desafiadora.
A eletroporação, que é um método comum para introduzir reagentes em linhagens celulares cultivadas, oferece uma alternativa à microinjeção para a entrega de componentes CRISPR-Cas9 em embriões. A eletroporação embrionária, demonstrada pela primeira vez em embriões de ratos8, tem sido utilizada com sucesso como método de liberação em camundongos 9,10,11,12,13, suínos 14,15 e outros organismos animaismodelo 16,17,18 . Os embriões, suspensos no meio contendo reagentes CRISPR-Cas9, são colocados em uma cubeta ou em uma lâmina de vidro entre dois eletrodos e submetidos a pulsos diretos de correntes elétricas. Isso cria aberturas transitórias na zona pelúcida e na membrana plasmática do embrião através das quais os componentes CRISPR-Cas9 entram nos embriões. Normalmente, pulsos elétricos de “poring” de nível médio são usados para criar as aberturas temporárias seguidas por “pulsos de transferência” elétricos de nível inferior que facilitam o movimento dos componentes de edição do genoma carregados negativamente. A eletroporação embrionária é eficiente, tem alto rendimento e é fácil de executar. No entanto, embora a eletroporação embrionária tenha se mostrado altamente bem-sucedida para a introdução de pequenos (<200 pb) modelos de reparo de ssDNA, há poucos relatos de eletroporação bem-sucedida de modelos de reparo maiores (>1,0 kb)13,19. Essa restrição de tamanho representa uma grande limitação da eletroporação embrionária por gerar modelos animais knock-in que requerem grandes inserções.
No contexto da terapia gênica, os vírus adenoassociados (AAVs) têm sido usados há muito tempo como veículos para liberar material genético devido à sua eficiente infectividade in vivo de células em divisão e não em divisão, ausência de patogenicidade e rara integração genômica20,21. Recentemente, mais estudos combinaram AAVs com a tecnologia CRISPR-Cas9 para introduzir modelos de reparo de DNA e reagentes CRISPR 22,23,24. Essa abordagem permite a entrega de modelos maiores de reparo de DNA sem a necessidade de técnicas de microinjeção.
A via HDR é mais ativa nas fases S tardia e G2 do ciclocelular25,26. Em estudos realizados in vitro, aumentos significativos na eficiência de knock-in foram alcançados pela entrega de RNPs CRISPR-Cas9 e modelos de reparo de DNA em células sincronizadas com G2 ou pela restrição da presença da proteína Cas9 às fases S e G2 tardias usando uma proteína de fusão Cas9-Geminin2. Além disso, há um grande evento de ativação do genoma zigótico (ZGA) que ocorre durante a fase G2 estendida do embrião em estágio de 2 células, e isso está associado a um estado de cromatina aberta. Especula-se que isso proporcione aos RNPs CRISPR-Cas9 e modelos de reparo maior acessibilidade ao DNA genômico.
Nosso objetivo foi desenvolver todas essas observações, combinando a abordagem AAV com eletroporação embrionária para introduzir RNPs CRISPR-Cas9 no estágio de 2 células do desenvolvimento embrionário. Essa estratégia aproveita a maior capacidade de entrega do molde de reparo de DNA do AAV, a facilidade técnica de eletroporação e o ponto de tempo de 2 células mais ideal para acessibilidade genômica durante o desenvolvimento do embrião para criar um método eficiente para engenharia genética direcionada de inserções de DNA. Como destacado neste protocolo, nosso método otimizado permite a produção de modelos de ratos knock-in direcionados carregando inserções de sequências de DNA de 1,2 a 3,0 kb de tamanho sem a necessidade de técnicas de microinjeção.
O sistema de edição do genoma CRISPR-Cas revolucionou o campo da engenharia genética ao permitir a produção eficiente de modificações genéticas simples e complexas e personalizadas em uma variedade de espécies animais. Refinamentos frequentes e melhorias nas técnicas associadas à edição do genoma aumentam sua versatilidade. Aqui descrevemos uma nova abordagem usando a entrega de DNA mediada por ssAAV juntamente com a eletroporação embrionária de 2 células de reagentes CRISPR-Cas9 em embriões de roedores…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Nolan Davis pela assistência com videografia e edição de vídeo.
Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |