アデノ随伴ウイルス(AAV)と2細胞胚エレクトロポレーションを用いたラット胚のCRISPR-Cas9ゲノム編集
Summary
このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。
Abstract
ゲノム編集技術は、ラットを含む遺伝子改変動物の製造に広く利用されています。DNA修復テンプレートとCRISPR-Cas試薬の細胞質または前核注入は、胚への最も一般的な送達方法です。しかし、この種のマイクロマニピュレーションは、特殊な機器へのアクセスを必要とし、手間がかかり、ある程度の技術力が必要です。さらに、マイクロインジェクション技術は、胚に機械的ストレスがかかるため、胚の生存率が低下することがよくあります。このプロトコルでは、マイクロインジェクションを必要とせずに、CRISPR-Cas9ゲノム編集と連動する大きなDNA修復テンプレートを送達するための最適化された方法を開発しました。このプロトコルは、2細胞胚を変更するためにエレクトロポレーションによるCRISPR-Cas9リボ核タンパク質(RNP)の送達とともに、一本鎖DNAドナーテンプレートのAAV媒介DNA送達を組み合わせたものです。この斬新な戦略を用いて、1.2〜3.0kbのDNA配列を42%〜90%の効率で挿入する標的ノックインラットモデルを作製することに成功しました。
Introduction
CRISPRベースのゲノム編集ツールの開発により、より洗練された新しい遺伝子改変ラットモデルを効率的に生成する能力が加速しました。シングルガイドRNAは、Cas9ヌクレアーゼとともに結合して、ゲノム内の目的のDNA配列を標的とするリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し、二本鎖DNA切断を引き起こします。細胞DNA修復機構はエラーが発生しやすいため、修復プロセス中に挿入および欠失(INDEL)が導入され、標的遺伝子の機能を破壊する可能性があります。ゲノム編集試薬とともに目的の改変DNA配列(修復テンプレート)が共送達されると、二本鎖DNA切断を含む領域への修復テンプレートの挿入は、相同性指向性修復(HDR)と呼ばれるプロセスを通じて行われます。これは、ターゲットDNAの挿入/置換(ノックイン)を持つ動物モデルを生成するための効果的な戦略です。1つの制限は、ノックイン配列がしばしばサイズが大きいことであり、これは遺伝子編集効率を低下させ、したがって、目的のモデルを生成することをより困難にすることが示されている1。ノックイン効率を高めるための戦略には、二本鎖DNA(dsDNA)と一本鎖DNA(ssDNA)の両方の修復テンプレートの直鎖化と、DNA修復テンプレートの化学修飾が含まれます2,3,4。さらに、HDR刺激化合物を伴う前核マイクロインジェクション、マイクロインジェクションと組み合わせた電気パルスの適用、および2細胞胚への時限マイクロインジェクションがすべて試みられています5,6,7。これらのアプローチのいくつかは成功していますが、1.0 kbを超えるDNA配列の取り込みは依然として技術的に困難です。
エレクトロポレーションは、培養細胞株に試薬を導入するための一般的な方法であり、CRISPR-Cas9成分を胚に送達するためのマイクロインジェクションの代替手段となります。胚エレクトロポレーションは、ラットの胚8で初めて実証され、その後、マウス9,10,11,12,13、ブタ14,15、その他の動物モデル生物16,17,18の送達方法として成功裏に用いられてきた.CRISPR-Cas9試薬を含む培地に懸濁した胚を、キュベットまたは2つの電極の間のスライドガラスに入れ、直接パルスの電流を流します。これにより、透明帯と胚の原形質膜に一時的な開口部が生じ、そこからCRISPR-Cas9成分が胚に入ります。典型的には、中レベルの電気的な「孔あけ」パルスを使用して一時的な開口部を作成し、その後に負に帯電したゲノム編集コンポーネントの移動を容易にする低レベルの電気的な「転送パルス」が続きます。胚エレクトロポレーションは効率的で、スループットが高く、実行が容易です。しかし、胚エレクトロポレーションは、小さな(<200 bp)のssDNA修復テンプレートの導入に非常に成功することが示されていますが、より大きな(>1.0 kb)の修復テンプレートのエレクトロポレーションが成功したという報告はほとんどありません13,19。このサイズ制限は、大きな挿入を必要とするノックイン動物モデルを生成するための胚エレクトロポレーションの大きな制限を表しています。
遺伝子治療の文脈では、アデノ随伴ウイルス(AAV)は、分裂細胞と非分裂細胞の両方の効率的なin vivo感染性、病原性の欠如、およびまれなゲノム統合により、遺伝物質を送達する媒体として長い間使用されてきました20,21。最近では、AAVとCRISPR-Cas9技術を組み合わせて、DNA修復テンプレートとCRISPR試薬を導入する研究が増えています22,23,24。このアプローチにより、マイクロインジェクション技術を必要とせずに、より大きなDNA修復テンプレートを送達することができます。
HDR経路は、細胞周期の後期S期およびG2期でより活発になります25,26。in vitroで実施された研究では、CRISPR-Cas9 RNPとDNA修復テンプレートをG2同期細胞に送達するか、Cas9-Geminin融合タンパク質を用いてCas9タンパク質の存在を後期S期およびG2期に制限することにより、ノックイン効率の大幅な向上が達成されました2。さらに、2細胞期の胚の拡張G2期に発生する主要な接合性ゲノム活性化(ZGA)イベントがあり、これはオープンクロマチン状態に関連しています。これにより、CRISPR-Cas9 RNPと修復テンプレートがゲノムDNAにアクセスしやすくなると推測されます。
私たちの目標は、AAVアプローチと胚エレクトロポレーションを組み合わせて、胚発生の2細胞段階でCRISPR-Cas9 RNPを導入することで、これらすべての観察結果に基づいて構築することでした。この戦略は、AAVのより大きなDNA修復テンプレート送達能力、エレクトロポレーションの技術的容易さ、および胚発生中のゲノムアクセスのためのより最適な2細胞時点を利用して、DNA挿入の標的遺伝子工学のための効率的な方法を作成します。このプロトコルで強調されるように、私達の最大限に活用された方法はmicroinjectionの技術の必要性なしでサイズの1.2から3.0 kbにDNAシーケンスの挿入を運ぶ目標とされたノックインラットモデルの生産を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Casゲノム編集システムは、さまざまな動物種において、単純な遺伝子組み換えと複雑な遺伝子組み換えの両方を効率的に生産できるようにすることで、遺伝子工学の分野に革命をもたらしました。ゲノム編集に関連する技術の頻繁な改良と改善により、その汎用性はさらに高まっています。ここでは、ssAAVを介したDNA送達と、CRISPR-Cas9試薬の2細胞胚エレクトロポレーションを2細胞げっ歯…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ビデオ撮影とビデオ編集の支援をしてくれたノーラン・デイビスに感謝します。
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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