CRISPR-Cas9 Genom-Editierung von Rattenembryonen mit Hilfe des Adeno-assoziierten Virus (AAV) und der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen
Summary
Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.
Abstract
Die Genom-Editing-Technologie wird häufig eingesetzt, um genetisch veränderte Tiere, einschließlich Ratten, zu züchten. Die zytoplasmatische oder pronukleäre Injektion von DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Cas-Reagenzien ist die häufigste Verabreichungsmethode in Embryonen. Diese Art der Mikromanipulation erfordert jedoch den Zugang zu spezialisierten Geräten, ist mühsam und erfordert ein gewisses Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus führen Mikroinjektionstechniken aufgrund der mechanischen Belastung des Embryos oft zu einer geringeren Überlebensrate des Embryos. In diesem Protokoll haben wir eine optimierte Methode entwickelt, um große DNA-Reparaturschablonen zu liefern, die in Verbindung mit der CRISPR-Cas9-Genom-Editierung arbeiten, ohne dass eine Mikroinjektion erforderlich ist. Dieses Protokoll kombiniert die AAV-vermittelte DNA-Verabreichung von einzelsträngigen DNA-Spendervorlagen mit der Verabreichung von CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein (RNP) durch Elektroporation, um 2-Zell-Embryonen zu modifizieren. Mit dieser neuartigen Strategie haben wir erfolgreich gezielte Knock-in-Rattenmodelle hergestellt, die DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb mit Wirkungsgraden zwischen 42 % und 90 % einfügen.
Introduction
Die Entwicklung von CRISPR-basierten Genom-Editierungswerkzeugen hat unsere Fähigkeit beschleunigt, neue und anspruchsvollere gentechnisch veränderte Rattenmodelle effizient zu erstellen. Single-guide-RNA wird zusammen mit Cas9-Nuklease kombiniert, um Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) zu bilden, die auf DNA-Sequenzen von Interesse innerhalb des Genoms abzielen und zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen. Da zelluläre DNA-Reparaturmechanismen fehleranfällig sind, werden während des Reparaturprozesses Insertionen und Deletionen (INDELs) eingeführt, die die Funktion eines Zielgens stören können. Wenn eine gewünschte modifizierte DNA-Sequenz (Reparatur-Matrize) zusammen mit Genom-Editing-Reagenzien verabreicht wird, erfolgt das Einfügen der Reparatur-Matrize in die Region, die den doppelsträngigen DNA-Bruch enthält, durch einen Prozess, der als homologiegesteuerte Reparatur (HDR) bezeichnet wird. Dies ist eine effektive Strategie zur Generierung von Tiermodellen mit gezielten DNA-Insertionen/-Substitutionen (Knock-Ins). Eine Einschränkung besteht darin, dass Knock-in-Sequenzen oft sehr groß sind, was nachweislich die Effizienz der Geneditierung verringert und somit die Generierung des gewünschten Modells erschwert1. Zu den Strategien zur Steigerung der Knock-in-Effizienz gehörten die Linearisierung von Reparaturschablonen für doppelsträngige DNA (dsDNA) und einzelsträngige DNA (ssDNA) sowie die chemische Modifikation von DNA-Reparaturschablonen 2,3,4. Darüber hinaus wurde die pronukleäre Mikroinjektion zusammen mit HDR-stimulierenden Verbindungen, die Anwendung von elektrischen Impulsen in Verbindung mit der Mikroinjektion und die zeitgesteuerte Mikroinjektion in 2-Zell-Embryonen versucht 5,6,7. Trotz des Erfolgs einiger dieser Ansätze bleibt der Einbau von DNA-Sequenzen, die größer als 1,0 kb sind, technisch anspruchsvoll.
Die Elektroporation, eine gängige Methode zum Einbringen von Reagenzien in kultivierte Zelllinien, bietet eine Alternative zur Mikroinjektion zur Verabreichung von CRISPR-Cas9-Komponenten in Embryonen. Die Elektroporation von Embryonen, die erstmals in Rattenembryonen8 nachgewiesen wurde, wurde seitdem erfolgreich als Verabreichungsmethode bei Mäusen 9,10,11,12,13, Schweinen 14,15 und anderen Tiermodellorganismen eingesetzt 16,17,18. Die Embryonen, die in dem Medium mit den CRISPR-Cas9-Reagenzien suspendiert sind, werden in eine Küvette oder auf einen Objektträger zwischen zwei Elektroden gegeben und direkten elektrischen Stromimpulsen ausgesetzt. Dadurch entstehen vorübergehende Öffnungen in der Zona pellucida und der Plasmamembran des Embryos, durch die die CRISPR-Cas9-Komponenten in die Embryonen gelangen. Typischerweise werden elektrische “Poring”-Impulse auf mittlerer Ebene verwendet, um die temporären Öffnungen zu erzeugen, gefolgt von elektrischen “Transferimpulsen” auf niedrigerer Ebene, die die Bewegung der negativ geladenen Genom-Editing-Komponenten erleichtern. Die Elektroporation von Embryonen ist effizient, hat einen hohen Durchsatz und ist einfach durchzuführen. Während sich die Elektroporation von Embryonen bei der Einführung kleiner (<200 bp) ssDNA-Reparaturschablonen als sehr erfolgreich erwiesen hat, gibt es nur wenige Berichte über eine erfolgreiche Elektroporation größerer (>1,0 kb) Reparaturschablonen13,19. Diese Größenbeschränkung stellt eine wesentliche Einschränkung der Embryo-Elektroporation für die Erzeugung von Knock-in-Tiermodellen dar, die große Insertionen erfordern.
Im Rahmen der Gentherapie werden Adeno-assoziierte Viren (AAVs) aufgrund ihrer effizienten In-vivo-Infektiosität sowohl von sich teilenden als auch von sich nicht teilenden Zellen, ihrer fehlenden Pathogenität und ihrer seltenen genomischen Integration seit langem als Vehikel für die Verabreichung von genetischem Material verwendet20,21. In jüngster Zeit wurden in weiteren Studien AAVs mit der CRISPR-Cas9-Technologie kombiniert, um DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Reagenzien einzuführen 22,23,24. Dieser Ansatz ermöglicht die Verabreichung größerer DNA-Reparaturschablonen, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind.
Der HDR-Signalweg ist in den späten S- und G2-Phasen des Zellzyklus aktiver25,26. In in vitro durchgeführten Studien wurden signifikante Steigerungen der Knock-in-Effizienz durch die Verabreichung von CRISPR-Cas9-RNPs und DNA-Reparatur-Templates in G2-synchronisierte Zellen oder durch die Beschränkung des Vorhandenseins des Cas9-Proteins auf späte S- und G2-Phasen unter Verwendung eines Cas9-Geminin-Fusionsproteins2 erreicht. Darüber hinaus gibt es ein wichtiges zygotisches Genomaktivierungsereignis (ZGA), das während der verlängerten G2-Phase des Embryos im 2-Zell-Stadium auftritt und mit einem offenen Chromatinzustand verbunden ist. Es wird spekuliert, dass dies den CRISPR-Cas9-RNPs und Reparaturvorlagen einen besseren Zugang zur genomischen DNA verschafft.
Unser Ziel war es, auf all diesen Beobachtungen aufzubauen, indem wir den AAV-Ansatz mit der Elektroporation von Embryonen kombinierten, um CRISPR-Cas9-RNPs im 2-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung einzuführen. Diese Strategie nutzt die größere DNA-Reparatur-Template-Lieferkapazität von AAV, die technische Leichtigkeit der Elektroporation und den optimaleren 2-Zell-Zeitpunkt für die genomische Zugänglichkeit während der Embryonalentwicklung, um eine effiziente Methode für die gezielte Genmanipulation von DNA-Insertionen zu schaffen. Wie in diesem Protokoll hervorgehoben, ermöglicht unsere optimierte Methode die Herstellung von gezielten Knock-in-Rattenmodellen mit Insertionen von DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Genom-Editing-System CRISPR-Cas hat die Gentechnik revolutioniert, indem es die effiziente Herstellung sowohl einfacher als auch komplexer, maßgeschneiderter genetischer Veränderungen in einer Vielzahl von Tierarten ermöglicht. Häufige Verfeinerungen und Verbesserungen der Techniken im Zusammenhang mit der Genom-Editierung erhöhen seine Vielseitigkeit. Hier haben wir einen neuen Ansatz beschrieben, der die ssAAV-vermittelte DNA-Verabreichung zusammen mit der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen von CRISPR-Cas9-R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Nolan Davis für die Unterstützung bei der Videografie und Videobearbeitung.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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