בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה
Summary
בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.
Abstract
HAT1, הידוע גם בשם היסטון אצטילטרנספראז 1, ממלא תפקיד מכריע בסינתזה של כרומטין על ידי ייצוב ואצטילציה של H4 מתהווה לפני הרכבת נוקלאוזומים. הוא נדרש לצמיחת הגידול במערכות שונות, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. כדי להקל על זיהוי תרכובות שיכולות לעכב פעילות אנזימטית של HAT1, פיתחנו בדיקת אצטיל-קליק לסינון מהיר. בבדיקה פשוטה זו, אנו משתמשים ב- HAT1/Rbap46 רקומביננטי, אשר מטוהר מתאים אנושיים פעילים. השיטה משתמשת באנלוגי אצטיל-CoA 4-pentynoyl-CoA (4P) בגישה כימיית קליק. זה כרוך בהעברה אנזימטית של ידית אלקין דרך תגובת אצילציה תלוית HAT1 לפפטיד H4 N-terminal ביוטינילציה. לאחר מכן הפפטיד שנלכד משותק על לוחות נויטרווידין, ולאחר מכן מתפקד כימיית קליק עם ביוטין-אזיד. לאחר מכן, גיוס סטרפטווידין-פרוקסידאז משמש לחמצון אדום אמפלקס, וכתוצאה מכך פלט פלואורסצנטי כמותי. על ידי החדרת מעכבים כימיים במהלך תגובת האצילציה, אנו יכולים לכמת עיכוב אנזימטי בהתבסס על הפחתה של האות הפלואורסצנטי. חשוב לציין, תגובה זו ניתנת להרחבה, ומאפשרת סינון בתפוקה גבוהה של מעכבים פוטנציאליים לפעילות אנזימטית HAT1.
Introduction
בין האצטילטרנספראזות האיקריוטיות הרבות, HAT1 היה ההיסטון אצטילטרנספראז הראשוני שבודד 1,2,3. מחקרים מאוחרים יותר ביססו היטב את תפקידו המרכזי בשכפול הכרומטין, במיוחד בסינתזה של נוקלאוזומים חדשים במהלך שלבS 4. מאמצי המחקר שלנו הובילו להכרה כי HAT1 מגורה מאוד על ידי טיפול בגורם גדילה אפידרמלי (EGF) בתאי חלב5. יתר על כן, התברר כי HAT1 נדרש להתרבות תאים מהירה והיווצרות גידולים in vivo 6,7,8,9. הנתונים מצביעים על כך ש- HAT1 הוא קריטי בתיאום תהליכים אנאבוליים ואפיגנטיים לחלוקת תאים, ומניע את צמיחת הגידול.
HAT1 di-acetylates זנב אמינו-טרמינלי של היסטון H4 על ליזין 5 ו 12 בקומפלקס עם חלבון מלווה Rbap46, אשר קושר את ההיסטון ומציג את האמינו-טרמינוס ל- HAT1. טטרמרים היסטון או דיזומים10, יחד עם HAT1/Rbap46 ומלווי היסטוןאחרים 11, מיובאים לאחר מכן לגרעין. לאחר מכן היסטונים משוחררים כדי להיות מופקדים במזלג השכפול, או באתרים אחרים כדי לתמוך בהפעלה או דיכוי של גנים. הפונקציה של סימן הדי-אצטילציה HAT1 על היסטון H4 אינה מובנת במלואה. סביר להניח שהוא מוסר במהירות בטווח של 15-30 דקות על ידי פעולה של deacetylases היסטון 12,13,14,15 לאחר H4 מוכנס לכרומטין. לפיכך, סימן הדי-אצטילציה HAT1 אינו מופץ בכרומטין ועשוי שלא לשמש תפקיד אפיגנטי אמיתי, אם כי תפקיד בגיוס אנזימים משנים כרומטין-לכרומטין המתהווה הועלה12. כמו כן, HAT1 אינו אצטילט כרומטין; פעילותו מוגבלת להיסטונים מסיסים.
הפיתוח של מעכבי אצטילטרנספראז היסטון במולקולות קטנות התעכב על ידי בדיקות לא ספציפיות ובעלות תפוקה נמוכה, ולעתים קרובות הביא ליצירת תרכובות תגובתיות ביולוגיות16,17. בדיקת תקן הזהב למדידת פעילויות אצטילטרנספראז דורשת שימוש ב- 3H-אצטיל-coA, המגביל את התפוקה ודורש קרינה. עם זאת, לאחרונה, מעכבי אצטילטרנספראז ספציפיים וחזקים מאוד של מולקולות קטנות המכוונות ל- CBP/p30018 ו- KAT6A/B19,20 תוארו ואושרו באמצעות שימוש ב- 3H-אצטיל-CoA. בהמשך, בדיקות משופרות כדי להשיג תפוקה טובה יותר ולהימנע מסכנות מעבדה מתוכננות.
ההתקדמות האחרונה בניטור אצטילציה21 השתמשה בכימיית קליקים כדי לאפשר ניטור תגובה אנזימטית. ישנם מגוון קודמנים תומכי קליק הנגישים במסלולים סינתטיים פשוטים או זמינים לרכישה שניתן לשלב בתגובות אנזימים. תגובות אלה מתבצעות בדרך כלל במערכות רקומביננטיות, אם כי בדיקות מבוססות תאים אפשריות גם22. היתרון של גורמים משלימים ומצעים התומכים בלחיצה הוא שהסינון יכול למדוד ישירות את פעילות האנזים ללא צורך במערכות קריאה מצומדות שלעתים קרובות מוטרדות על ידי תרכובות סינון ודורשות שלבי טיפול נוספים. זה מאפשר טיפולים מעכבים רק בשלב האנזימטי, בעוד שכל שלבי התפקוד והזיהוי במורד הזרם מתבצעים לאחר שטיפה נרחבת כדי להסיר תרכובות, ובכך מגבילים את הפוטנציאל להתרחשות הפרעות בבדיקה. יתרונות אלה הופכים את העיצוב של בדיקות מותאמות קליק לעדיף על פני בדיקות מצומדות המסתמכות בדרך כלל על זיהוי של קואנזים חופשי A.
שיקול חשוב אחד הוא הקבלה של גורמים משלימים התומכים בקליקים לאתר הפעיל של האנזים. ייתכן שגורמים משלימים קיימים המותאמים לשימוש בקליקים לא יהיו תואמים באופן מלא לאתר הפעיל הממוטב עבור הגורם המשותף המקורי. מידע מבני ומידול יכולים לשמש לתכנון תחליפי חומצות אמינו כדי להגדיל את האתר הפעיל כדי לשלב מצעים שהשתנו23. זה עשוי לאפשר סינון עם קינטיקה אנזימית משופרת ורמות נמוכות יותר של סובסטרט ואנזימים. החיסרון של גישה זו הוא שכיסים קטליטיים שהשתנו עשויים שלא לזהות מעכבים המקיימים אינטראקציה חזקה עם האנזים המקומי. בסופו של דבר, נדרש שילוב של גישות כדי לזהות ולאמת מעכבי אנזימים פוטנציאליים.
במאמר זה אנו מתארים שיטה שפותחה לטיהור והערכה של פעילות האנזים HAT1 באמצעות קו-פקטור קליק 4-פנטינואיל-CoA24. בדיקה זו (איור 1) משתמשת ברצף האנזים המקורי בקומפלקס עם החלבון השותף הנדרש Rbap46, אשר הוכח כמגביר את פעילות האנזים. טיהור האנזים מתאי האדם מאפשר הפעלת אנזים בצלולו, מה שעשוי לשמר שינויים מעוררים לאחר התרגום החשובים לפעילות אנזימית מלאה. תכנון ואופטימיזציה של בדיקות אנזימים רקומביננטיים עבור מסכים כימיים בעלי תפוקה גבוהה שימשו בהצלחה לזיהוי ואפיון מעכבי מולקולות קטנות HAT1.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעשור האחרון, כימיית הקליק הפכה לבולטת20, ואפשרה תכנון מדויק של מבנים כימיים אינטראקציה. בהקשר זה, קשרים קוולנטיים ביו-אורתוגונליים שונים21 התגלו כאפשרויות מבטיחות ליצירת קומפלקסים בסביבתם הטבעית. כימיית קליקים משתמשת בזוגות של קבוצות פונקציונליות המציגות תגובו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג’ורג ‘ז’נג על מתן H4K12CoA. אנו מודים לחברי מעבדת גרובר על דיונים מועילים ומשוב. אנו מודים לתמיכה של NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) וקרן V (V2022-022).
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
- Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
- Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
- Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
- Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
- Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
- Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
- Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
- Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
- Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
- Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
- Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
- Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
- Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
- Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
- Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
- Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
- He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
- Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).
- Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
- Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
- Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
- Parker, C. G., Pratt, M. R. Click chemistry in proteomic investigations. Cell. 180 (4), 605-632 (2020).
- Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
- Radziwon, K., Weeks, A. M. Protein engineering for selective proteomics. Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
