Ацетил-клик-химический анализ для измерения ацетилирования гистон-ацетилтрансферазы 1

Среди многочисленных эукариотических ацетилтрансфераз HAT1 был исходной гистон-ацетилтрансферазой, которая была выделена ^1,2,3. Последующие исследования твердо установили его ключевую роль в репликации хроматина, особенно в синтезе новых нуклеосом во время S-фазы⁴. Наши исследования привели к признанию того, что HAT1 сильно стимулируется лечением эпидермального фактора роста (EGF) в клетках молочной железы⁵. Кроме того, выяснилось, что HAT1 необходим для быстрой пролиферации клеток и образования опухолей in vivo 6,7,8,9. Данные указывают на то, что HAT1 имеет решающее значение в координации анаболических и эпигенетических процессов деления клеток, стимулируя рост опухоли.

HAT1 диацетилирует аминоконцевой хвост гистона H4 на лизинах 5 и 12 в комплексе с белком-шапероном Rbap46, который связывает гистон и представляет аминоконцевой конец HAT1. Затем тетрамеры или дисомы^{гистонов 10} вместе с HAT1/Rbap46 и другими шаперонами^{гистонов 11} импортируются в ядро. Затем гистоны высвобождаются, чтобы отложиться в репликационной вилке или других местах для поддержки активации или репрессии генов. Функция метки диацетилирования HAT1 на гистон H4 до конца не изучена. Вероятно, он быстро удаляется в течение 15-30 мин под действием гистондеацетилаз 12,13,14,15 после вставки H4 в хроматин. Таким образом, метка диацетилирования HAT1 не размножается в хроматине и может не играть истинной эпигенетической роли, хотя постулируется роль в рекрутировании хроматин-модифицирующих ферментов в зарождающийся хроматин¹². Кроме того, HAT1 не ацетилирует хроматин напрямую; Его активность ограничена растворимыми гистонами.

Разработка низкомолекулярных ингибиторов гистон-ацетилтрансферазы затрудняется неспецифическими и малопроизводительными анализами, часто приводящими к образованию биологически реакционноспособных соединений^16,17. Золотой стандарт анализа для измерения активности ацетилтрансферазы требует использования 3H-ацетил-коА, что ограничивает пропускную способность и требует облучения. Тем не менее, в последнее время были описаны и подтверждены специфические и высокоэффективные низкомолекулярные ингибиторы ацетилтрансферазы, нацеленные на CBP/p300¹⁸ и KAT6A/B^19,20 с использованием 3-H-ацетил-КоА. В дальнейшем разрабатываются более совершенные анализы для достижения большей пропускной способности и предотвращения лабораторных опасностей.

Недавние достижения в области мониторинга ацетилирования²¹ позволили использовать клик-химию для обеспечения мониторинга ферментативных реакций. Существует множество прекурсоров с поддержкой щелчков, которые доступны простыми синтетическими путями или доступны для покупки, которые могут быть включены в ферментативные реакции. Эти реакции, как правило, проводятся в рекомбинантных системах, хотя клеточные анализы также возможны²². Преимущество кофакторов и субстратов с поддержкой щелчков заключается в том, что скрининг может напрямую измерять активность ферментов без необходимости использования связанных систем считывания, которые часто нарушаются просеивающими соединениями и требуют дополнительных действий по обработке. Это позволяет проводить обработку ингибиторами только на ферментативной стадии, в то время как все последующие этапы функционализации и детектирования выполняются после обширной промывки для удаления соединений, что ограничивает возможность возникновения интерференции при анализе. Эти преимущества делают разработку анализов с поддержкой щелчков предпочтительнее связанных анализов, которые обычно полагаются на обнаружение свободного коэнзима А.

Одним из важных соображений является принятие кофакторов, включенных щелчками, в активный центр фермента. Существующие кофакторы с поддержкой кликов могут быть не полностью совместимы с активным сайтом, оптимизированным для собственного кофактора. Структурная информация и моделирование могут быть использованы для разработки аминокислотных замен для увеличения активного центра для включения измененных субстратов²³. Это может позволить проводить скрининг с улучшенной кинетикой ферментов и более низкими уровнями субстратов и ферментов. Недостаток этого подхода заключается в том, что измененные каталитические карманы могут не идентифицировать ингибиторы, которые сильно взаимодействуют с нативным ферментом. В конечном счете, для выявления и валидации потенциальных ингибиторов ферментов требуется комбинация подходов.

В данной статье мы опишем метод, разработанный для очистки и анализа активности фермента HAT1 с использованием клик-кофактора 4-пентиноил-КоА²⁴. В этом анализе (рис. 1) последовательность нативного фермента используется в комплексе с его необходимым партнерским белком Rbap46, который, как было показано, повышает активность фермента. Очистка фермента из клеток человека позволяет активировать фермент в целлюло, что может сохранить стимулирующие посттрансляционные модификации, важные для полной активности фермента. Разработка и оптимизация анализов рекомбинантных ферментов для высокопроизводительных химических скринингов были успешно использованы для идентификации и характеристики низкомолекулярных ингибиторов HAT1.