概要

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

Published: January 26, 2024
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概要

特定の阻害剤をスクリーニングするための迅速かつ正確な化学アッセイは、医薬品開発の武器庫における重要なツールです。ここでは、HAT1アセチル化活性の阻害を測定するためのスケーラブルなアセチルクリックケミストリーアッセイを紹介します。

Abstract

HAT1は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1とも呼ばれ、ヌクレオソーム形成前に新生H4を安定化およびアセチル化することにより、クロマチン合成において重要な役割を果たします。さまざまなシステムでの腫瘍増殖に必要であり、がん治療の標的となる可能性があります。HAT1酵素活性を阻害する化合物の同定を容易にするために、迅速なスクリーニングのためのアセチルクリックアッセイを考案しました。この簡便なアッセイでは、活性化されたヒト細胞から精製された組換えHAT1/Rbap46を用います。この分析法では、アセチル-CoA 類似体である 4-ペンチノイル-CoA(4P)をクリックケミストリーアプローチで利用します。これには、HAT1依存性アシル化反応によるアルキンハンドルのビオチン化H4 N末端ペプチドへの酵素的転写が含まれます。捕捉したペプチドはニュートラアビジンプレート上に固定化され、続いてビオチン-アジドによるクリックケミストリー官能基化が行われます。続いて、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼリクルートメントを使用してアンプレックスレッドを酸化し、定量的な蛍光出力が得られます。アシル化反応中に化学的阻害剤を導入することで、蛍光シグナルの減少に基づいて酵素阻害を定量することができます。重要なことは、この反応はスケーラブルであり、HAT1酵素活性の潜在的な阻害剤のハイスループットスクリーニングを可能にすることです。

Introduction

数ある真核生物のアセチルトランスフェラーゼの中で、HAT1は最初に単離されたヒストンアセチルトランスフェラーゼであった1,2,3。その後の研究により、クロマチン複製、特にS期4期の新しいヌクレオソームの合成における極めて重要な役割が確固たるものとなりました。研究の結果、HAT1は乳腺細胞の上皮成長因子(EGF)処理によって高度に刺激されることが認識されました5。さらに、HAT1はin vivoでの急速な細胞増殖と腫瘍形成に必要であることが明らかになっています6,7,8,9。データによると、HAT1は細胞分裂の同化プロセスとエピジェネティックプロセスの調整に不可欠であり、腫瘍の増殖を促進します。

HAT1は、ヒストンH4のアミノ末端テールをリジン5および12上のジアセチル化し、シャペロンタンパク質Rbap46と複合体でヒストンに結合し、アミノ末端をHAT1に提示します。ヒストン四量体または二体10は、HAT1/Rbap46および他のヒストンシャペロン11とともに、核に取り込まれる。その後、ヒストンは放出され、複製フォークまたは他の部位に沈着し、遺伝子の活性化または抑制をサポートします。ヒストンH4に対するHAT1ジアセチル化マークの機能は完全には解明されていません。H4がクロマチンに挿入された後、ヒストン脱アセチル化酵素12,13,14,15の作用により、15〜30分のスパン内に迅速に除去される可能性があります。したがって、HAT1ジアセチル化マークはクロマチン中で伝播せず、真のエピジェネティックな役割を果たさない可能性があるが、新生クロマチンへのクロマチン修飾酵素の動員における役割は仮定されている12。また、HAT1はクロマチンを直接アセチル化しません。その活性は可溶性ヒストンに限定されています。

低分子ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤の開発は、非特異的で低スループットのアッセイによって妨げられており、多くの場合、生物学的に反応性化合物の生成を引き起こしています16,17。アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのゴールドスタンダードアッセイでは、3H-アセチル-coAを使用する必要があるため、スループットが制限され、放射線が必要です。それにもかかわらず、最近、CBP/p30018およびKAT6A/B19,20を標的とする特異的で非常に強力な低分子アセチルトランスフェラーゼ阻害剤が記載され、3つのH-アセチルCoAの使用によって確認されています。今後は、スループットを向上させ、実験室での危険を回避するための改良されたアッセイが考案されています。

アセチル化モニタリング21 の最近の進歩により、クリックケミストリーが利用され、酵素反応モニタリングが可能になった。クリック対応の前駆体には、単純な合成経路で入手できるものや、酵素反応に組み込むことができる購入可能なものがあります。これらの反応は通常、組換え系で行われるが、細胞ベースのアッセイも実行可能である22。クリック対応の補因子および基質の利点は、スクリーニング化合物によってしばしば摂動され、追加の取り扱いステップを必要とする結合読み出しシステムを必要とせずに、スクリーニングで酵素活性を直接測定できることです。これにより、酵素ステップ中にのみ阻害剤処理が可能になり、下流のすべての機能化および検出ステップは、化合物を除去するために広範な洗浄後に実行されるため、アッセイ干渉が発生する可能性が制限されます。これらの利点により、クリック対応アッセイの設計は、遊離コエンザイムAの検出に一般的に依存する結合アッセイよりも好ましいものになります。

重要な考慮事項の1つは、酵素活性部位へのクリック可能補因子の受け入れです。既存のクリック対応補因子は、ネイティブ補因子用に最適化されたアクティブサイトと完全に互換性がない場合があります。構造情報およびモデリングを使用して、改変された基質を取り込むために活性部位を拡大するためのアミノ酸置換を設計することができる23。これにより、酵素動態を改善し、基質と酵素のレベルを下げたスクリーニングが可能になる場合があります。このアプローチの欠点は、変化した触媒ポケットが天然酵素と強く相互作用する阻害剤を同定できない可能性があることです。最終的には、潜在的な酵素阻害剤を同定し、検証するために、複数のアプローチを組み合わせる必要があります。

ここでは、クリック補因子4-ペンチノイル-CoAを用いてHAT1酵素活性を精製およびアッセイするために開発された方法24について述べる。このアッセイ(図1)では、天然の酵素配列を、酵素活性を高めることが示されている必要なパートナータンパク質Rbap46と複合体で使用します。ヒト細胞から酵素を精製すると、 セルローの酵素活性化が可能になり、完全な酵素活性に重要な刺激的な翻訳後修飾が保存される可能性があります。ハイスループットケミカルスクリーニングのための組換え酵素アッセイの設計と最適化は、HAT1低分子阻害剤の同定と特性評価に使用されています。

Protocol

1.方法1:組換えHAT1 / Rbap46複合体の生成と精製 HEK293f細胞の融解、回収、増殖100 mLフラスコ中で、1〜1,000万個のHEK293f哺乳類細胞26 を30 mLのフリースタイル293発現培地に解凍します。8% CO2 を 37 °C で 60 rpm で回転させながらインキュベートします。 翌日、細胞の生存率をカウントして確認し、回転速度を120rpmに調整します。1 L フラスコで 300 mL 培養液に増殖させ、播種密度を 500,000 細胞/mL に維持し、密度が 3 x 106 cells/mL を超える前に細胞を分割します。 HEK293fトランスフェクション5 x 105 cells/mL を 1 L フラスコで 300 mL 培養し、24 時間培養します。翌日、細胞を数えて、7.5 x 105 から 1.2 x 106 cells/mL の間であることを確認します。 30 mL の PBS 中に 300 μg の pHEK-FLAG-HAT1 と 300 μg の pHEK-Rbap46 プラスミド DNA の混合物を調製します。1.2 mLのポリエチレンイミン(PEI)をDNA/PBSに添加し、混合します。室温で20分間インキュベートし、DNA/PBS/PEI ミックスを 300 mL 培養液に加え、37°C、48時間、120 rpm でインキュベートします。 細胞の採取細胞を数えて、1.7 x 106 から 2.5 x 106 cells/mL の間になるようにします。この細胞密度で、フォルスコリンを最終濃度12.5 μMに添加してHAT1を活性化し、細胞を30分、37°C、120rpmでインキュベートします。 細胞を300× g で5分間ペレット化し、30mLのPBSで1回洗浄し、液体N2で急速凍結します。タンパク質が精製されるまで-80°Cで保存するか、直接精製に進みます。 HAT1/Rbap46錯体FLAGビーズ精製細胞を溶解し、タンパク質抽出物を調製します。50 mL の RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7.5、500 mM NaCl、25 mM MgCl2) にプロテアーゼ阻害剤カクテル (PIC) 1 錠を加えて溶解緩衝液を調製します。 氷上で300 mL培養した細胞ペレットを融解し、0.1% Triton X-100を含む40 mLの氷冷溶解バッファーで溶解します。氷上で超音波処理し、10,000 x g で 4°C で 10 分間スピンダウンします。 すべての上清を氷上の1本の50 mLチューブに集め、これがタンパク質抽出物となります。 FLAGビーズを用意します。5 mL の 0.1 M グリシン pH 3.5、0.01% Triton X-100 を含む各チューブに 400 μL の M2-FLAG アガロースビーズスラリーを添加して、FLAG ビーズを 4 本の 15 mL コニカルチューブに分割します。各チューブを手で5秒間激しく振ってください。 4°C、1000 x g で30秒間パルス遠心分離し、上清を吸引し、5 mLのRSB-500 + 0.1% Triton X-100(Tx-100;プロテアーゼ阻害剤なし)で2回洗浄し、氷上でインキュベートします。 FLAG免疫沈降を行います。洗浄したビーズを含む各15 mLコニカルチューブに10 mLのタンパク質抽出物を加えます。チューブを4°Cで逆回転させて、少なくとも90分間または一晩インキュベートします。 結合ビーズをRSB-500 + 0.1%Tx-100の10mLで5回洗浄します。洗浄のたびに、チューブを2x〜5x反転させてビーズを再懸濁し、1000 x g で4°Cで1分間ペレット化します。 最後に、RSB-100(20 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、25 mM MgCl2)+ 0.1% Tx-100で1回洗浄します。 FLAGペプチド溶出:0.5 mg/mLのFLAGペプチドを含む1.5 mLの溶出バッファー(EB)でHAT1複合体を溶出します。4°Cで少なくとも1時間または一晩インキュベートします。溶出したビーズを1000 x g で4°Cで30秒間パルス遠心分離し、精製されたHAT1/Rbap46複合体を含む上清を回収します。 タンパク質を濃縮し、FLAGペプチドを除去します。20 mL、10,000ダルトンカットオフフィルターチューブに溶出液を添加します。EBで容量を15 mLまで上げます。2500 x g で 4 °C で 15 分間、15 mL の EB を追加して 2 回繰り返します。 フィルターチューブから最終溶出液を回収し、A260でタンパク質濃度を確認します。6 mL の EB 中に 1 mg の総タンパク質の濃度が期待できます(培養開始 300 mL あたり)。SDS-PAGE、Coomassie、およびイムノブロッティングによりタンパク質の純度を確認し、アリコートを-80°Cで保存します。 2. 方法2:HAT1アセチルクリック検量線 検量線の準備ポジティブコントロールのH4 N末端ペプチドを、SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotin)]([Pra]はプロパルギルグリシン)の配列で合成します。 PraペプチドをDMSOに0.1 mg/mLに再懸濁します。Pra ペプチドをビオチン化ヒストン H4 ペプチド(1-23-GGK-ビオチン)と混合して、検量線を作成します(図 2、容量は 表 1 に記載)。検量線は、プレート結合前に新鮮にするか、事前に作成している場合は、20 μL の 8 M 尿素と混合し、ステップ 3.3 まで -20 °C で保存することができます。 3. 方法3:HAT1アセチルクリックアッセイ アセチル化反応と試験阻害剤の組み立て0.1 mg/mL(34.8 μM)までDMSOに再懸濁したビオチン化ヒストンH4ペプチド(1-23-GGK-ビオチン)、EBで希釈したHAT1酵素、20倍バッファー(1M Tris pH 8.5、0.1% NP40)、2 mM DTT、4-ペンチノイル-CoAを1 mg/mL(1 mM)まで水に溶解した成分から、0.2 mL PCRチューブまたは96ウェルPCRプレートでアセチル化反応を2回組み立てます。20 μLの反応液は、10 μLの酵素、1 μLのH4ペプチド、1 μLの20xバッファー、1 μLのDTTを事前に混合し、氷上の96ウェルPCRプレートのウェルに分注したもので構成されます。 1ウェルあたり1μLのDMSO(ネガティブコントロール)または1〜10μMに溶解した試験化合物、またはH4K12CoA25 (または適切なポジティブコントロール阻害剤)を添加します。穏やかなピペッティングで混合し、氷上で10分間インキュベートして、酵素:阻害剤複合体を形成します。 アセチル化反応の継続2 μL の 4-ペンチノイル-CoA と 4 μL の水を混ぜ合わせ、ウェルに加えます。ピペッティングで穏やかに混合し、室温で300 x g で30秒間遠心分離して内容物を回収し、キャップ付きチューブまたは再封可能なホイル付きのプレートで37°Cで1時間インキュベートします。 内容物を直接処理して反応生成物を得るか、20 μLの8 M尿素で急冷し、処理するまで-20°Cで保存します。 ニュートラアビジンプレートへのペプチド結合ウシ血清アルブミン(BSA)に、尿素の有無にかかわらず、ウェルあたり80 μLのPBST(PBS + 0.1% Tween-20)を含むブロック済みの黒色ニュートラビジンコーティング96ウェルプレートに反応内容物を添加します。 標準曲線ペプチドを、80 μL の PBST を含むウェルに複製して添加します。室温(RT)で1時間穏やかに軌道振とうでペプチドを結合します。 洗浄:結合が完了したら、ウェルから液体を吸引し、プレートウォッシャーを使用して200μLのPBSTで3x 15ストローク(180μLのストローク量)でウェルを洗浄します。 クリック化学反応100 mM Tris(3-hydroxypropyltriazolymethyl)アミン(THPTA)配位子を水中に、20 mM CuSO4 を水中に溶融して、クリック反応用の試薬を調製します。THPTAは、Cu(II)触媒による加水分解を防ぎ、O2 / Cu /アスコルビン酸から生成されたラジカルと過酸化物をクエンチします。 THPTA/Cu 混合物を 300 mM アスコルビン酸ナトリウム水溶液および2.5 mM ビオチンアジド DMSO 溶液に加えます。ワンクリック反応には、140 μLのPBS、10 μLのTHPTA、10 μLのCuSO4、10 μLのアスコルビン酸ナトリウム、20 μLのビオチン-アジドが含まれています。クリック試薬を常に新鮮に混合し、各ウェルに 190 μL を分注し、プレートを密封し、37°C で 1 時間インキュベートします。 洗浄:ウェルから液体を吸引し、プレートをPBSTで3回洗浄します(ストローク量180 μL、各洗浄で15ストローク)。 ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合:ストレプトアビジン-HRP(0.224 mg/mL)をストレプトアビジン(0.224 mg/mL)で1:10に希釈し、さらにPBSTで1:1000に希釈します。ステプトアビジン-HRP:ストレプトアビジンミックス(ウェルあたり100 μL)を添加し、穏やかな眼窩振とうで室温で1時間インキュベートします。 前の手順と同様にPBSTで3回洗浄します。 アンプレックスレッド酸化4.45 mL の NaHPO4 バッファー(1x = 50 mM の最終濃度)、50 μL のアンプレックスレッド(20 mM を DMSO で希釈)、500 μL の希釈 H2O2 として Amplex red 検出試薬を組み合わせます。 H2O2を1x NaHPO4バッファーで30%ストックから3%に希釈し、次いで22.7μLの3%H2O2を977μLの1x NaHPO4バッファー(これはアンプレックス反応に用いるH2O2)に加える。ウェルあたり100 μLのアンプレックスレッド反応混合物を添加し、光から保護した室温で30分間インキュベートした後、標準的な蛍光プレートリーダーを使用して571/585 nmの蛍光励起/発光を検出します。 酵素阻害の計算:阻害率(図 3)を次の式に従って計算します:ここで、D は DMSO のみで処理したコントロール反応の蛍光値、X は試験化合物で処理した反応の値、BG はバックグラウンドウェル(H4 ペプチドコントロール、酵素添加なし)の値です。 用量曲線:HAT1酵素活性を阻害することが判明した試験化合物を選択し、化合物を段階希釈して繰り返しアッセイします。化合物の希釈を経験的に決定します。例えば、ストック濃度 2 mM から始めて、1:3 に段階希釈して 8 回希釈します。次に、1:20 を酵素アッセイに希釈し、100 μM のトップ用量が得られます。曲線のプロット:最小二乗回帰を使用して、データ解析ソフトウェア(GraphPad Prism)で用量反応阻害曲線(ステップ3.10の阻害率値を使用)を適合させ、各化合物のIC50 値を導き出します(図4)。 アセチルCoAとのアセチル化反応:これを使用して、4-ペンチノイルCoAの代わりに天然補因子アセチルCoAで酵素活性を確認します。ステップ3.1-3.2で説明したように、4-ペンチノイルCoAの代わりにアセチルCoAを用いてHAT1アセチル化アッセイを実施します。 反応生成物をニトロセルロースメンブレン(1〜2 μL)にスポットし、乾燥させてから、抗H4-リジン-12-アセチル抗体または抗H4-リジン-5-アセチル抗体でドットブロットします。デンシトメトリーでイムノブロットシグナルを定量します。

Representative Results

適切なアッセイ性能を確保するために、すべてのプレートに重複した標準曲線(16ウェル)を含める必要があります。検量線データは、溶液中の Pra 含有ペプチドと未変性 H4 ペプチドの比率に応じて、100% から 0% の範囲で表形式で設定する必要があります(表 1)。アンプレックスレッドシグナルは、100% pra/0% ネイティブ H4 ペプチドウェルで最も高く、0% pra/100% ネイティブ H4 ペプチド?…

Discussion

過去10年間で、クリックケミストリーが顕著になり20、相互作用する化学構造の正確な設計が可能になりました。この文脈の中で、種々の生体直交共有結合21 が、それらの自然環境において複合体を形成するための有望な選択肢として浮上してきた。クリックケミストリーは、一般に「クリック反応」として知られる、迅速で選択的な反応を示す官能基のペ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

H4K12CoAを提供してくださったGeorge Zheng氏に感謝します。有益な議論とフィードバックを提供してくれたGruber Labのメンバーに感謝します。NIH/NCI(1K08CA245024)、CPRIT(RR200090)、V財団(V2022-022)からの支援に感謝します。

Materials

4P CoA Cayman Chemical 10547 Click chemistry co-factor
Amplex Red Fisher Sci A12222 Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide Alfa Aesar J64996MC Click chemistry
Copper Sulfate Sigma-aldrich  7758-98-7 Click chemistry
DMSO Fisher Scientific  67-68-5 diluent
DTT Acros Organics 03-12-3483 reducting agent
Forskolin VWR 102987-310 Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium Thermo Fisher 12338018 Media
Freestyle 293-F cells Thermo Fisher R790-07 Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin Anaspec AS65097 peptide substrate
HEPES Sigma-aldrich  7365-45-9 EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution Sigma-aldrich  Z00183-99-0 initiator
M2 FLAG antibody slurry Millipore-Sigma A2220 Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab) VWR 89131-980 Protein purification
Neutravidin Plate Thermo Sci 15127 BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL) MP Biomedical 198596 20x buffer
pHEK-293 plasmid Takara Bio 3390 Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x Alfa Aesar  Z00082-33-6 wash buffer
Pra peptide Genscript Custom synthesis biotinylated
Sodium Ascorbate Sigma-aldrich  134-03-2 Click chemistry
Sodium chloride Sigma-aldrich  7647-14-5 EB buffer
Sodium phosphate VWR International 7558-80-7 buffer
Streptavidin EMD Millipore 189730 competitor
Streptavidin-HRP Cell Signaling 3999S enzyme
THPTA ligand Fisher Sci 1010-500 Click chemistry
Tris base Sigma-aldrich  77-86-1 20x buffer
Triton-X 100 VWR International  9002-93-1 EB buffer
Tween-20 Sigma-aldrich  9005-64-5 Wash buffer
Urea Sigma-Aldrich 57-13-6 quencher

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記事を引用
Rajkumar, S., Dixon, D., Lipchik, A. M., Gruber, J. J. An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation. J. Vis. Exp. (203), e66054, doi:10.3791/66054 (2024).

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