JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Артериовенозная метаболомика для измерения обмена метаболитов in vivo в бурой жировой ткани

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

В этом протоколе изложены методы, релевантные для BAT-оптимизированной артериовенозной метаболомики с использованием ГХ-МС на мышиной модели. Эти методы позволяют получить ценную информацию о BAT-опосредованном обмене метаболитов на уровне организма.

Abstract

Бурая жировая ткань (BAT) играет решающую роль в регулировании метаболического гомеостаза посредством уникального процесса расхода энергии, известного как термогенез без дрожания. Для достижения этой цели BAT использует разнообразное меню циркулирующих питательных веществ для поддержания своей высокой метаболической потребности. Кроме того, BAT выделяет биоактивные факторы, полученные из метаболитов, которые могут служить либо метаболическим топливом, либо сигнальными молекулами, облегчая BAT-опосредованную внутритканевую и/или межтканевую коммуникацию. Это говорит о том, что BAT активно участвует в системном обмене метаболитов, интересная особенность, которая начинает изучаться. Здесь мы представляем протокол для оптимизированного артериовенозного метаболомики БАТ на уровне мышей in vivo . Протокол фокусируется на соответствующих методах термогенной стимуляции и технике забора артериовенозной крови с использованием вены Зульцера, которая избирательно дренирует межлопаточную венозную кровь, полученную из BAT, и системную артериальную кровь. Затем демонстрируется протокол метаболомики на основе газовой хроматографии с использованием этих образцов крови. Использование этого метода должно расширить понимание метаболитов, регулируемого БАТ на межорганном уровне, путем измерения чистого поглощения и высвобождения метаболитов БАТ.

Introduction

Бурая жировая ткань (BAT) обладает уникальным свойством расхода энергии, известным как недрожащий термогенез (NST), который включает в себя как митохондриальный разъединяющий белок 1 (UCP1), так и UCP1-независимый механизмы 1,2,3,4,5. Эти отличительные характеристики указывают на то, что БАТ участвует в регуляции системного метаболизма и патогенезе метаболических заболеваний, включая ожирение, сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания и раковую кахексию 6,7,8. Недавние ретроспективные исследования показали обратную связь между массой БАТ и/или ее метаболической активностью с ожирением, гипергликемией и кардиометаболическим здоровьем у людей 9,10,11.

Недавно BAT был предложен в качестве метаболического поглотителя, ответственного за поддержание NST, поскольку он требует значительного количества циркулирующих питательных веществ в качестве термогенного топлива 6,7. Кроме того, BAT может генерировать и высвобождать биологически активные факторы, называемые коричневыми адипокинами или BATokines, которые действуют как эндокринные и/или паракринные сигналы, что указывает на его активное участие в метаболическом гомеостазе на системном уровне 12,13,14,15. Таким образом, понимание метаболизма питательных веществ БАТ должно улучшить наше понимание его патофизиологического значения для человека, выходящего за рамки его традиционной роли в качестве органа терморегуляции.

Метаболомные исследования с использованием стабильных изотопных индикаторов в сочетании с классическими исследованиями поглощения питательных веществ с использованием неметаболизируемых радиоиндикаторов значительно улучшили наше понимание того, какие питательные вещества предпочтительно поглощаются БАТ и как они используются 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Например, исследования радиоактивных индикаторов показали, что БАТ, активированный холодом, поглощает глюкозу, жирные кислоты, связанные с липопротеинами, и аминокислоты с разветвленной цепью 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Недавнее отслеживание изотопов в сочетании с метаболомными исследованиями позволило нам измерить метаболическую судьбу и поток этих питательных веществ в тканях и культивируемых клетках 24,25,26,28,29,30. Тем не менее, эти анализы в первую очередь сосредоточены на индивидуальном использовании питательных веществ, оставляя нам ограниченные знания о роли BAT на системном уровне в обмене метаболитов органов. Вопросы, касающиеся конкретных серий циркулирующих питательных веществ, потребляемых БАТ, и их количественного вклада в пересчете на углерод и азот, остаются неясными. Кроме того, изучение того, может ли BAT генерировать и высвобождать метаболиты BATokines (например, липокины) с использованием питательных веществ, только начинается 12,13,14,15,31,32.

Артериовенозный анализ крови является классическим физиологическим подходом, используемым для оценки специфического поглощения или высвобождения циркулирующих молекул в органах/тканях. Этот метод ранее применялся к межлопаточной БАТ крыс для измерения кислорода и нескольких метаболитов, тем самым установив БАТ в качестве основного места адаптивного термогенеза с его катаболическим потенциалом 33,34,35,36,37. Недавно артериовенозное исследование с использованием межлопаточного БАТ крыс было объединено с трансомиксным подходом, что привело к идентификации неоткрытых BATokins, высвобождаемых термогенно стимулированным BAT38.

Последние достижения в области высокочувствительной газовой хроматографии и жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС и ЖХ-МС) на основе метаболомики возродили интерес к артериовенозным исследованиям для количественного анализа органоспецифического метаболитного обмена 39,40,41. Эти методы, обладающие высокой разрешающей способностью и точностью по массе, позволяют проводить всесторонний анализ широкого спектра метаболитов с использованием небольших количеств образцов.

В соответствии с этими достижениями недавнее исследование успешно адаптировало артериовенозную метаболомику для изучения БАТ на мышином уровне, что позволило провести количественный анализ активности обмена метаболитов в БАТ вразличных условиях. В данной статье представлен протокол артериовенозной метаболомики, нацеленный на BAT, с использованием ГХ-МС на мышиной модели C57BL/6J.

Protocol

Все эксперименты проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Сонгюнгван. Мыши были помещены в одобренное IACUC помещение для животных, расположенное в чистом помещении с температурой 22 °C и влажностью 45% в соответствии с …

Representative Results

На рисунке 1 показана экспериментальная схема BAT-оптимизированной AV-метаболомики. Как упоминалось в разделе «Протокол», для получения дифференциально стимулированной бурой жировой ткани мыши проходят температурную акклиматизацию с помощью инкубаторов грызунов или п?…

Discussion

Важным шагом в понимании метаболического потенциала БАТ в энергетическом балансе всего организма является определение того, какие питательные вещества он потребляет, как они метаболически перерабатываются и какие метаболиты высвобождаются в кровоток. Этот протокол представляет соб…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим всех сотрудников лабораторий Чхве и Юнга за методологическую дискуссию. Благодарим К. Янга и Д. Гертина за советы и отзывы. Благодарим М.С. Чой за критическое прочтение рукописи. Эта работа была профинансирована NRF-2022R1C1C1012034 S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 в D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 в S.M.J. и D.W.C. Эта работа была поддержана Чхуннамским национальным университетом для W.T.K. Рисунки 1 и 2 были созданы с помощью BioRender (http://biorender.com/).

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes – ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5′-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man’s adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Tags

Arteriovenous MetabolomicsMetabolite ExchangeEnergy ExpenditureThermogenesisMouse ModelGas Chromatography-based Metabolomics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image