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Biochemistry

Arteriovenöse Metabolomik zur Messung des In-vivo-Metabolitenaustauschs in braunem Fettgewebe

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

In diesem Protokoll werden Methoden beschrieben, die für die BAT-optimierte arteriovenöse Metabolomik mittels GC-MS in einem Mausmodell relevant sind. Diese Methoden ermöglichen es, wertvolle Einblicke in den BAT-vermittelten Metabolitenaustausch auf organismischer Ebene zu gewinnen.

Abstract

Braunes Fettgewebe (BAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der metabolischen Homöostase durch einen einzigartigen Energieverbrauchsprozess, der als nicht-zitternde Thermogenese bekannt ist. Um dies zu erreichen, verwendet BAT ein vielfältiges Menü an zirkulierenden Nährstoffen, um seinen hohen Stoffwechselbedarf zu decken. Darüber hinaus sezerniert BAT aus Metaboliten gewonnene bioaktive Faktoren, die entweder als Stoffwechselbrennstoffe oder Signalmoleküle dienen können, was die BAT-vermittelte Kommunikation innerhalb von Geweben und/oder zwischen Geweben erleichtert. Dies deutet darauf hin, dass BAT aktiv am systemischen Metabolitenaustausch beteiligt ist, ein interessantes Merkmal, das allmählich erforscht wird. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vivo optimierte arteriovenöse Metabolomik auf Mausebene vor. Das Protokoll konzentriert sich auf relevante Methoden zur thermogenen Stimulation und eine arteriovenöse Blutentnahmetechnik unter Verwendung der Sulzer-Vene, die selektiv interskapuläres BAT-abgeleitetes venöses Blut und systemisches arterielles Blut ableitet. Als nächstes wird ein auf Gaschromatographie basierendes Metabolomik-Protokoll unter Verwendung dieser Blutproben demonstriert. Der Einsatz dieser Technik sollte das Verständnis des BVT-regulierten Metabolitenaustauschs auf der Ebene der Organe erweitern, indem die Nettoaufnahme und -freisetzung von Metaboliten durch BVT gemessen wird.

Introduction

Braunes Fettgewebe (BAT) besitzt eine einzigartige Eigenschaft des Energieverbrauchs, die als nicht-zitternde Thermogenese (NST) bekannt ist und sowohl mitochondriale Entkopplungsprotein 1 (UCP1)-abhängige als auch UCP1-unabhängige Mechanismen 1,2,3,4,5 umfasst. Diese charakteristischen Merkmale deuten darauf hin, dass BAT an der Regulation des systemischen Stoffwechsels und der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Adipositas, Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebskachexie, beteiligt ist 6,7,8. Neuere retrospektive Studien haben einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der BAT-Masse und/oder ihrer Stoffwechselaktivität mit Fettleibigkeit, Hyperglykämie und kardiometabolischer Gesundheit beim Menschen gezeigt 9,10,11.

In jüngster Zeit wurde BAT als metabolische Senke vorgeschlagen, die für die Aufrechterhaltung der NST verantwortlich ist, da sie erhebliche Mengen an zirkulierenden Nährstoffen als thermogenen Brennstoff benötigt 6,7. Darüber hinaus kann BAT bioaktive Faktoren erzeugen und freisetzen, die als braune Adipokine oder BATokine bezeichnet werden und als endokrine und/oder parakrine Signale wirken, was auf seine aktive Beteiligung an der metabolischen Homöostase auf Systemebene hinweist 12,13,14,15. Daher sollte das Verständnis des Nährstoffstoffwechsels von BAT unser Verständnis seiner pathophysiologischen Bedeutung beim Menschen verbessern, die über seine herkömmliche Rolle als thermoregulatorisches Organ hinausgeht.

Metabolomische Studien mit stabilen Isotopen-Tracern in Kombination mit klassischen Nährstoffaufnahmestudien mit nicht metabolisierbaren Radiotracern haben unser Verständnis darüber, welche Nährstoffe bevorzugt von BAT aufgenommen werden und wie sie verwertet werden, erheblich verbessert 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. So haben beispielsweise Studien zu radioaktiven Tracern gezeigt, dass kaltaktivierte BAT Glukose, Lipoprotein-gebundene Fettsäuren und verzweigtkettige Aminosäuren 16,17,18,19,20,21,22,23,27 aufnimmt. Die jüngste Isotopenverfolgung in Kombination mit metabolomischen Studien hat es uns ermöglicht, das metabolische Schicksal und den Fluss dieser Nährstoffe in Geweben und kultivierten Zellen zu messen 24,25,26,28,29,30. Diese Analysen konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf die individuelle Verwertung von Nährstoffen, so dass wir nur begrenzte Kenntnisse über die Rolle von BAT auf Systemebene beim Austausch von Organmetaboliten haben. Fragen zu den spezifischen Reihen zirkulierender Nährstoffe, die von BAT verbraucht werden, und zu ihren quantitativen Beiträgen in Bezug auf Kohlenstoff und Stickstoff sind nach wie vor schwer fassbar. Darüber hinaus steht die Untersuchung, ob BAT aus Metaboliten gewonnene BATokine (z. B. Lipokine) unter Verwendung von Nährstoffen erzeugen und freisetzen kann, erst am Anfang 12,13,14,15,31,32.

Die arteriovenöse Blutanalyse ist ein klassischer physiologischer Ansatz, um die spezifische Aufnahme oder Freisetzung von zirkulierenden Molekülen in Organen/Geweben zu beurteilen. Diese Technik wurde zuvor auf die interskapuläre BAT von Ratten angewendet, um Sauerstoff und verschiedene Metaboliten zu messen, wodurch BAT als Hauptort der adaptiven Thermogenese mit seinem katabolen Potenzial etabliertwurde 33,34,35,36,37. Kürzlich wurde eine arteriovenöse Studie mit interscapularer BAT der Ratte mit einem Trans-Omics-Ansatz gekoppelt, was zur Identifizierung unentdeckter BATokine führte, die durch thermogen stimuliertes BAT38 freigesetzt wurden.

Jüngste Fortschritte in der hochempfindlichen Gaschromatographie- und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS und LC-MS)-basierten Metabolomik haben das Interesse an arteriovenösen Studien zur quantitativen Analyse des organspezifischen Metabolitenaustauschs neu entfacht 39,40,41. Diese Techniken mit ihrem hohen Auflösungsvermögen und ihrer Massengenauigkeit ermöglichen die umfassende Analyse eines breiten Spektrums von Metaboliten mit kleinen Probenmengen.

In Übereinstimmung mit diesen Fortschritten wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie die arteriovenöse Metabolomik erfolgreich für die Untersuchung von BAT auf Mausebene angepasst, wodurch die quantitative Analyse der Metabolitenaustauschaktivitäten bei BAT unter verschiedenen Bedingungen ermöglichtwurde 42. In diesem Artikel wird ein BAT-gerichtetes arteriovenöses Metabolomik-Protokoll unter Verwendung von GC-MS in einem C57BL/6J-Mausmodell vorgestellt.

Protocol

Alle Versuche wurden mit Genehmigung des Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer von der IACUC zugelassenen Tierhaltung untergebracht, die sich in einem Reinraum bei 22 °C und 45 % Luftfeuchtigkeit nach einem täglichen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus befand. Sie wurden in belüfteten Racks gehalten und hatten Zugang zu einer Standard-Chow-Diät ad libitum (bestehend aus 60 % Kohlenhydraten, 16 % Protein und 3 % Fett). Einstreu und Nistmateri…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt das experimentelle Schema der BAT-optimierten AV-Metabolomik. Wie im Abschnitt “Protokoll” erwähnt, werden Mäuse zur Gewinnung von differentiell stimuliertem braunem Fettgewebe einer Temperaturakklimatisierung mit Nagetier-Inkubatoren unterzogen oder erhalten eine pharmakologische Verabreichung wie β-adrenerge Rezeptoragonisten. Anschließend werden die Mäuse betäubt und Blutproben für die metabolomische Analyse entnommen (Abbildung 1A). …

Discussion

Ein entscheidender Schritt zum Verständnis des metabolischen Potenzials von BAT im Energiehaushalt des gesamten Körpers besteht darin, zu definieren, welche Nährstoffe es verbraucht, wie sie metabolisch verarbeitet werden und welche Metaboliten in den Kreislauf freigesetzt werden. Dieses Protokoll führt eine spezielle arteriovenöse Probenahmetechnik ein, die den Zugang zum venösen Gefäßsystem von interscapularer BAT und systemischen arteriellen Gefäßen bei C57BL/6J-Mäusen ermöglicht, die kürzlich von Park et…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitgliedern der Choi- und Jung-Laboratorien für die methodische Diskussion. Wir danken C. Jang und D. Guertin für Ratschläge und Rückmeldungen. Wir danken M.S. Choi für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von NRF-2022R1C1C1012034 an S.M.J. finanziert; NRF-2022R1C1C1007023 bis D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 an S.M.J. und D.W.C. Diese Arbeit wurde von der Chungnam National University für W.T.K. unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender (http://biorender.com/) erstellt.

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
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Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
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