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Biochemistry

褐色脂肪組織における 生体内 代謝物交換を測定する動静脈メタボロミクス

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/66012
, , , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences,Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology,Korea University

Summary

このプロトコルでは、マウスモデルのGC-MSを使用してBAT最適化された動静脈メタボロミクスに関連する方法が概説されています。これらの方法により、生物レベルでのBATを介した代謝物交換に関する貴重な洞察を得ることができます。

Abstract

褐色脂肪組織(BAT)は、非震え熱発生として知られる独自のエネルギー消費プロセスを通じて、代謝ホメオスタシスの調節に重要な役割を果たします。これを達成するために、BATは循環栄養素の多様なメニューを利用して、その高い代謝需要をサポートします。さらに、BATは代謝物由来の生理活性因子を分泌し、代謝燃料またはシグナル伝達分子として機能し、BATを介した組織内および/または組織間情報伝達を促進します。このことは、BATが全身の代謝物交換に積極的に関与していることを示唆しており、この興味深い特徴が研究され始めています。ここでは、 in vivo マウスレベルで最適化されたBAT動静脈メタボロミクスのプロトコールを紹介します。プロトコルは選択式に肩甲骨間BAT由来の静脈血および全身の幹線血を排出するSulzerの静脈を使用してthermogenic刺激および動静脈の採血技術のための関連した方法に焦点を合わせる。次に、これらの血液サンプルを用いたガスクロマトグラフィーベースのメタボロミクスプロトコルを実証します。この技術の使用は、BATによる代謝産物の正味の取り込みと放出を測定することにより、臓器間レベルでのBAT制御代謝物交換の理解を広げるはずです。

Introduction

褐色脂肪組織(BAT)は、ミトコンドリアの脱共役タンパク質1(UCP1)依存性およびUCP1非依存性メカニズムの両方を含む、非震え熱発生(NST)として知られる独自のエネルギー消費特性を持っています1,2,3,4,5。これらの特徴的な特徴は、BATが全身代謝の調節と、肥満、2型糖尿病、心血管疾患、癌悪液質などの代謝性疾患の病因に関与しています6,7,8。最近のレトロスペクティブ研究では、BAT量および/またはその代謝活動と肥満、高血糖、および心臓代謝の健康との逆相関が示されていますヒト9,10,11。

近年、BATは熱発生燃料として大量の循環栄養素を必要とするため、NSTの維持を担う代謝吸収源として提案されている6,7。さらに、BATは、内分泌および/またはパラクリンシグナルとして作用する褐色アディポカインまたはBATokinesと呼ばれる生理活性因子を生成および放出することができ、システムレベルの代謝ホメオスタシスへの積極的な関与を示しています12,13,14,15。したがって、BATの栄養代謝を理解することは、体温調節器官としての従来の役割を超えて、ヒトにおけるその病態生理学的意義の理解を深めるはずです。

安定同位体トレーサーを用いたメタボロミクス研究は、非代謝性放射性トレーサーを用いた古典的な栄養素摂取研究と組み合わせることで、BATが優先的に取り込む栄養素とその利用方法に関する理解を大幅に向上させました16,17,18,19,20,21,22,23,24,25、26、27。例えば、放射性トレーサー研究は、低温活性化BATがグルコース、リポタンパク質結合脂肪酸、および分岐鎖アミノ酸を取り込むことを実証しています16,17,18,19,20,21,22,23,27.メタボロミクス研究と組み合わせた最近の同位体追跡により、組織および培養細胞内のこれらの栄養素の代謝運命とフラックスを測定することが可能になりました24,25,26,28,29,30。しかし、これらの解析は、主に栄養素の個々の利用に焦点を当てており、臓器代謝物交換におけるBATのシステムレベルの役割に関する知識は限られています。BATが消費する循環栄養素の特定のシリーズと、炭素と窒素に関するそれらの定量的寄与に関する疑問は、依然としてとらえどころのないままです。さらに、BATが栄養素を使用して代謝物由来のBATokine(リポカインなど)を生成および放出できるかどうかの調査は、12,13,14,15,31,32始まったばかりです。

動静脈血液分析は、臓器/組織における循環分子の特定の取り込みまたは放出を評価するために使用される古典的な生理学的アプローチです。この技術は、以前にラットの肩甲間BATに適用され、酸素といくつかの代謝産物を測定し、それによってBATをその異化能33,34,35,36,37を伴う適応熱発生の主要な部位として確立しました。最近、ラット肩甲骨間BATを用いた動静脈研究とトランスオミクスアプローチが組み合わされ、熱刺激されたBATによって放出される未発見のBATokinesの同定につながりました38。

近年の高感度ガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー質量分析(GC-MSおよびLC-MS)ベースのメタボロミクスの進歩により、臓器特異的な代謝産物交換の定量分析のための動静脈研究への関心が再燃しています39,40,41。これらの手法は、高い分離能と質量精度を備えているため、少量のサンプルで幅広い代謝物を包括的に分析できます。

これらの進歩に沿って、最近の研究では、動静脈メタボロミクスをマウスレベルでBATの研究に適合させることに成功し、さまざまな条件下でのBATの代謝産物交換活性の定量分析が可能になりました42。本稿では、C57BL/6JマウスモデルにおけるGC-MSを用いたBAT標的動静脈メタボロミクスプロトコルについて紹介します。

Protocol

すべての実験は、成均館大学動物実験委員会(IACUC)の承認を得て行われました。マウスは、22°C、湿度45%に設定されたクリーンルームにあるIACUC承認の動物施設に収容され、毎日12時間の明暗サイクルが続きました。彼らは換気されたラックに保管され、標準的なチャウダイエット(60%の炭水化物、16%のタンパク質、3%の脂肪を含む)にアクセスできました。寝具や巣材は週替わりで変更しました?…

Representative Results

図1 は、BATに最適化されたAVメタボロミクスの実験スキームを示しています。プロトコルのセクションで述べられるように、差動的に刺激された褐色の脂肪ティッシュを得るためには、マウスは齧歯類の定温器を使用して温度の順化を経るか、またはβアドレナリン作動性受容器のアゴニストのような薬理学的な管理を受ける。その後、マウスに麻酔をかけ、メタボロミ?…

Discussion

全身のエネルギーバランスにおけるBATの代謝ポテンシャルを理解するための重要なステップは、BATが消費する栄養素、それらがどのように代謝処理されるか、およびどの代謝産物が循環に放出されるかを定義することです。このプロトコルは、Parkら42によって最近開発および検証されたC57BL / 6Jマウスの肩甲骨間BATおよび全身性動脈血管系の静脈血管系へのアクセスを可能に…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

方法論的な議論をしてくれたChoiとJungの研究室のメンバー全員に感謝します。C. Jang 氏と D. Guertin 氏のアドバイスとフィードバックに感謝します。原稿を批判的に読んでくれたM.S. Choiに感謝します。この研究は、NRF-2022R1C1C1012034 から S.M.J. に資金提供されました。NRF-2022R1C1C1007023からDWC;NRF-2022R1A4A3024551 から S.M.J. および D.W.C.この研究は、忠南大学校WTKの支援を受けて行われました。 図1と図2はBioRender(http://biorender.com/)を使用して作成されました。

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C
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Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).
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