Визуализация в режиме реального времени акросомальной динамики кальция и экзоцитоза в живых сперматозоидах мышей
Summary
Мышиная модель AcroSensE и описанные здесь методы визуализации живых клеток обеспечивают новый подход к изучению динамики кальция в субклеточном компартменте акросомы сперматозоида и того, как они регулируют промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.
Abstract
Экзоцитоз акросом (АЭ), при котором единственный экзоцитотический везикул сперматозоида сливается с плазматической мембраной, является сложным, кальций-зависимым процессом, необходимым для оплодотворения. Тем не менее, наше понимание того, как кальциевая сигнализация регулирует АЭ, все еще не завершено. В частности, взаимосвязь между внутриакросомальной динамикой кальция и промежуточными стадиями, ведущими к НЯ, четко не определена. Здесь мы описываем метод, который дает пространственное и временное представление о акросомальной динамике кальция и ее связи со слиянием мембран и последующим экзоцитозом акросомного везикулы. В методе используется новая трансгенная мышь, экспрессирующая сенсор экзоцитоза, нацеленный на акросомы (AcroSensE). Датчик сочетает в себе генетически кодируемый кальциевый индикатор (GCaMP), смешанный с mCherry. Этот гибридный белок был специально разработан для одновременного наблюдения за акросомальной динамикой кальция и событиями слияния мембран. Мониторинг акросомальной динамики кальция и АЭ в живых сперматозоидах AcroSensE в режиме реального времени достигается с помощью комбинации визуализации с высокой частотой кадров и системы доставки стимулятора, которая может быть нацелена на один сперматозоид. Этот протокол также содержит несколько примеров основных методов количественной оценки и анализа необработанных данных. Поскольку модель AcroSensE является генетически закодированной, ее научная значимость может быть увеличена за счет использования легкодоступных генетических инструментов, таких как скрещивание с другими генетическими моделями мышей или методы, основанные на редактировании генов (CRISPR). С помощью этой стратегии можно решить роль дополнительных сигнальных путей в капажировании и оплодотворении сперматозоидов. Таким образом, описанный здесь метод представляет собой удобный и эффективный инструмент для изучения динамики кальция в специфическом субклеточном компартменте – акросоме сперматозоида – и того, как эта динамика регулирует промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.
Introduction
Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению во время процесса, называемого капациацией1. Одной из конечных точек этого процесса является то, что сперматозоиды приобретают способность подвергаться НЯ. Данные, собранные за два десятилетия, подтверждают наличие сложной, многоступенчатой модели НЯ в сперматозоидах млекопитающих (обобщенная в 2,3). Однако изучение НЯ в живых сперматозоидах является сложной задачей, а имеющиеся в настоящее время методы мониторинга этого процесса с адекватным разрешением громоздки и требуют нескольких подготовительных этапов4, ограничиваются выявлением конечной стадии АЭ (например, с помощью ПНА5), ограничиваются измерениями изменений цитозольного кальция (в отличие от акросомальной динамики кальция), или ограничиваются измерениями цитозольной динамики кальция или АЭ6.
Чтобы преодолеть некоторые из ключевых ограничений исследований АЭ в реальном времени в физиологических условиях и исследовать взаимодействие между динамикой кальция и АЭ, была создана уникальная модель мышей. В этой мышиной модели гибридный белок, состоящий из генетически кодируемого сенсора Ca2+ (GCaMP3) и mCherry, экспрессируется и нацелен на акросому с помощью промотора акрозина и сигнального пептида2. Прицельный двойной датчик GCaMP3-mCherry позволяет в режиме реального времени одновременно измерять концентрацию кальция и состояние акросомального содержимого в живых сперматозоидах в физиологических условиях с помощью микроскопии и одноклеточной системы доставки стимулятора (рис. 1). Как компонент акросомального матрикса, слияние мембран и АЭ приводят к потере фотостабильной и pH-нечувствительной флуоресценции mCherry из сперматозоидов, поскольку этот белок диффундирует из везикулы акросомы. В этом отношении способность модели отражать время и возникновение АЭ сродни преимуществам акросомно-ориентированной линии GFP 7,8,9.
Вариант GCaMP3, используемый в этой линейке трансгенных мышей, имеет приблизительный KD 400 мкМ и динамический диапазон для Ca2+ 10-4-10-3 M10, что подходит для этого везикулы. Мы показали, что эта комбинация признаков GCaMP3 может выявить образование пор слияния между плазматической мембраной и наружной акросомальной мембраной (ОАМ)2. Обнаружение слияния пор является результатом того, что размер пор слишком мал, чтобы позволить белку AcroSensE диспергироваться из акросомы (за счет потери содержимого акросомы), обеспечивая при этом мембранный «канал», который обеспечивает приток ионов Ca2+ в просвет акросомы, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции GCaMP3.
Яркий, мономерный, не чувствительный к кальцию флуоресцентный белок mCherry поддерживает визуализацию акросомы при слабом сигнале GCaMP3 (например, до связыванияCa2+ , рис. 2), и, что важно, он также позволяет идентифицировать акросомные интактные сперматозоиды, пригодные для визуализации.
В следующем протоколе описывается использование уникальной модели мыши AcroSensE и методов микроскопии, используемых экспериментально для изучения динамики НЯ и кальция сперматозоидов с высоким пространственным и временным разрешением.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе описан метод, основанный на микроскопии, использующий недавно сгенерированную модель мыши AcroSensE для мониторинга отдельных клеток в режиме реального времени и анализа взаимодействия между акросомальной динамикой кальция и промежуточными этапами, ведущими к АЭ. Вместе ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01-HD093827 и R03-HD090304 (A.J.T.).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
