Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien
Summary
Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.
Abstract
Die Akrosom-Exozytose (AE), bei der das einzelne exozytotische Vesikel der Spermien mit der Plasmamembran verschmilzt, ist ein komplexer, kalziumabhängiger Prozess, der für die Befruchtung unerlässlich ist. Unser Verständnis darüber, wie die Kalziumsignalisierung die AE reguliert, ist jedoch noch unvollständig. Insbesondere das Zusammenspiel zwischen intraakrosomaler Kalziumdynamik und den Zwischenschritten, die zur AE führen, ist nicht gut definiert. Hier beschreiben wir eine Methode, die räumliche und zeitliche Einblicke in die akrosomale Kalziumdynamik und deren Beziehung zur Membranfusion und anschließenden Exozytose des Akrosomvesikels liefert. Die Methode verwendet eine neuartige transgene Maus, die einen Akrosomen-gerichteten Sensor für Exozytose (AcroSensE) exprimiert. Der Sensor kombiniert einen genetisch kodierten Kalziumindikator (GCaMP), der mit mCherry fusioniert ist. Dieses Fusionsprotein wurde speziell entwickelt, um die gleichzeitige Beobachtung von akrosomaler Kalziumdynamik und Membranfusionsereignissen zu ermöglichen. Die Echtzeitüberwachung der akrosomalen Kalziumdynamik und AE in lebenden AcroSensE-Spermien wird durch eine Kombination aus Bildgebung mit hoher Bildrate und einem Stimulanzien-Verabreichungssystem erreicht, das auf einzelne Spermien abzielen kann. Dieses Protokoll enthält auch mehrere Beispiele für grundlegende Methoden zur Quantifizierung und Analyse der Rohdaten. Da das AcroSensE-Modell genetisch kodiert ist, kann seine wissenschaftliche Bedeutung durch die Verwendung leicht verfügbarer genetischer Werkzeuge wie Kreuzungen mit anderen genetischen Modellen der Maus oder auf der Genom-Editierung (CRISPR) basierende Methoden erhöht werden. Mit dieser Strategie können die Rollen zusätzlicher Signalwege bei der Spermienkapazität und -befruchtung aufgeklärt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode ein bequemes und effektives Werkzeug darstellt, um die Kalziumdynamik in einem bestimmten subzellulären Kompartiment – dem Spermienakrosom – zu untersuchen und wie diese Dynamik die Zwischenschritte reguliert, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.
Introduction
Spermien erwerben die Fähigkeit zur Befruchtung während eines Prozesses, der als Kapazitation1 bezeichnet wird. Ein Endpunkt dieses Prozesses ist, dass die Spermien die Fähigkeit erwerben, AE zu durchlaufen. Daten aus mehr als zwei Jahrzehnten belegen das Vorhandensein eines komplexen, mehrstufigen Modells der AE in Säugetierspermien (zusammengefasst in 2,3). Die Untersuchung von AE in lebenden Spermien ist jedoch eine Herausforderung, und die derzeit verfügbaren Methoden zur Überwachung dieses Prozesses mit ausreichender Auflösung sind umständlich und erfordern mehrere Präparationsschritte4, beschränken sich auf den Nachweis des letzten Schritts der AE (z. B. unter Verwendung von PNA5), beschränken sich auf Messungen von Veränderungen des zytosolischen Kalziums (im Gegensatz zur akrosomalen Kalziumdynamik), oder beschränken sich auf Messungen der zytosolischen Kalziumdynamik oder der AE6.
Um einige der wichtigsten Einschränkungen von Echtzeit-AE-Studien unter physiologischen Bedingungen zu überwinden und die Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Kalziumdynamik und AE zu ermöglichen, wurde ein einzigartiges Mausmodell generiert. In diesem Mausmodell wird ein Fusionsprotein, das aus dem genetisch kodierten Ca2+-Sensor (GCaMP3) und mCherry besteht, exprimiert und mit Hilfe eines Acrosin-Promotors und eines Signalpeptids2 auf das Akrosom ausgerichtet. Der gezielte duale GCaMP3-mCherry-Sensor ermöglicht die gleichzeitige Echtzeitmessung der Kalziumkonzentration und des Status des akrosomalen Inhalts in lebenden Spermien unter physiologischen Bedingungen unter Verwendung von Mikroskopie und einem Einzelzell-Stimulanzien-Verabreichungssystem (Abbildung 1). Als Bestandteil der akrosomalen Matrix würden Membranfusion und AE zum Verlust der photostabilen und pH-unempfindlichen mCherry-Fluoreszenz aus den Spermien führen, da dieses Protein aus dem Akrosomvesikel diffundiert. In dieser Hinsicht ist die Fähigkeit des Modells, den Zeitpunkt und das Auftreten von AE zu reflektieren, vergleichbar mit den Vorteilen der Akrosom-gerichteten GFP-Mauslinie 7,8,9.
Die in dieser transgenen Mauslinie verwendete GCaMP3-Variante hat eine ungefähre KD von 400 μM und einen Dynamikbereich für Ca2+ von 10-4-10-3 M10, der für dieses Vesikel geeignet ist. Wir konnten zeigen, dass diese Kombination von Eigenschaften von GCaMP3 die Bildung von Fusionsporen zwischen der Plasmamembran und der äußeren akrosomalen Membran (OAM) aufdecken kann2. Die Fusionsporendetektion ist darauf zurückzuführen, dass die Porengröße zu klein ist, um es dem AcroSensE-Protein zu ermöglichen, sich aus dem Akrosom zu dispergieren (durch Verlust des Akrosomgehalts), während gleichzeitig ein Membran-“Kanal” bereitgestellt wird, der den Einstrom von Ca2+-Ionen in das Akrosomlumen ermöglicht, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des GCaMP3 führt.
Das helle, monomere, nicht-kalziumempfindliche fluoreszierende Protein mCherry unterstützt die Visualisierung des Akrosoms, während das GCaMP3-Signal schwach ist (z. B. vor der Ca2+ -Bindung, Abbildung 2), und ermöglicht vor allem auch die Identifizierung von Akrosom-intakten Samenzellen, die für die Bildgebung geeignet sind.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung des einzigartigen AcroSensE-Mausmodells und der Methoden für die Mikroskopie, die experimentell verwendet werden, um die Kalziumdynamik von AE und Spermien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird eine mikroskopiebasierte Methode beschrieben, um das neu generierte AcroSensE-Mausmodell für die Echtzeit-Einzelzellüberwachung und -analyse des Zusammenspiels zwischen akrosomaler Kalziumdynamik und Zwischenschritten, die zu AE führen, zu nutzen. Zusammen mit leicht verfügbaren genetischen Ansätzen, wie z. B. der Kreuzung mit anderen genetischen Modellen der Maus oder der Geneditierung, bieten dieses Modell und diese Methode ein leistungsfähiges System, um die Rolle verschiedener Komponenten und Signalwe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01-HD093827 und R03-HD090304 (A.J.T.) unterstützt.
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
