Real-time beeldvorming van acrosomale calciumdynamiek en exocytose in levend muizensperma
Summary
Het AcroSensE-muismodel en de hier beschreven beeldvormingsmethoden voor levende cellen bieden een nieuwe benadering voor het bestuderen van de calciumdynamiek in het subcellulaire compartiment van het sperma-acrosoom en hoe deze tussenstappen reguleren die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.
Abstract
Acrosoom-exocytose (AE), waarbij het enkele exocytotische blaasje van het sperma versmelt met het plasmamembraan, is een complex, calciumafhankelijk proces dat essentieel is voor bevruchting. Ons begrip van hoe calciumsignalering AE reguleert, is echter nog steeds onvolledig. Met name de wisselwerking tussen intra-acrosomale calciumdynamiek en de tussenstappen die tot AE leiden, is niet goed gedefinieerd. Hier beschrijven we een methode die ruimtelijk en temporeel inzicht geeft in de acrosomale calciumdynamiek en hun relatie met membraanfusie en daaropvolgende exocytose van het acrosoomblaasje. De methode maakt gebruik van een nieuwe transgene muis die een Acrosoom-gerichte sensor voor exocytose (AcroSensE) tot expressie brengt. De sensor combineert een genetisch gecodeerde calciumindicator (GCaMP) gefuseerd met mCherry. Dit fusie-eiwit is speciaal ontworpen om de gelijktijdige observatie van acrosomale calciumdynamiek en membraanfusiegebeurtenissen mogelijk te maken. Real-time monitoring van de acrosomale calciumdynamiek en AE in levend AcroSensE-sperma wordt bereikt met behulp van een combinatie van beeldvorming met hoge framesnelheid en een stimulerend toedieningssysteem dat zich kan richten op enkelvoudig sperma. Dit protocol geeft ook verschillende voorbeelden van basismethoden om de ruwe gegevens te kwantificeren en te analyseren. Omdat het AcroSensE-model genetisch gecodeerd is, kan de wetenschappelijke betekenis ervan worden vergroot door gebruik te maken van direct beschikbare genetische hulpmiddelen, zoals kruising met andere genetische muismodellen of op genbewerking (CRISPR) gebaseerde methoden. Met deze strategie kunnen de rollen van aanvullende signaalroutes bij de capacitatie en bevruchting van sperma worden opgelost. Samenvattend biedt de hier beschreven methode een handig en effectief hulpmiddel om de calciumdynamiek in een specifiek subcellulair compartiment – het sperma-acrosoom – te bestuderen en hoe die dynamiek de tussenstappen reguleert die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.
Introduction
Sperma verwerft het vermogen om te bevruchten tijdens een proces dat capacitatie1 wordt genoemd. Een eindpunt van dit proces is dat het sperma het vermogen verwerft om AE te ondergaan. Meer dan twee decennia aan gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een complex, meerstapsmodel van AE in sperma van zoogdieren (samengevat in 2,3). Het bestuderen van AE in levend sperma is echter een uitdaging, en de momenteel beschikbare methoden om dit proces met voldoende resolutie te volgen, zijn omslachtig en vereisen meerdere voorbereidingsstappen4, zijn beperkt tot de detectie van de laatste stap van AE (bijv. met behulp van PNA5), zijn beperkt tot metingen van veranderingen in cytosolisch calcium (in tegenstelling tot de acrosomale calciumdynamiek), of zijn beperkt tot metingen van cytosolische calciumdynamiek of AE6.
Om enkele van de belangrijkste beperkingen van real-time AE-studies onder fysiologische omstandigheden te overwinnen en om onderzoek naar de wisselwerking tussen calciumdynamiek en AE mogelijk te maken, werd een uniek muismodel gegenereerd. In dit muismodel wordt een fusie-eiwit bestaande uit de genetisch gecodeerde Ca2+-sensor (GCaMP3) en mCherry tot expressie gebracht en gericht op het acrosoom met behulp van een acrosinepromotor en signaalpeptide2. De gerichte dubbele GCaMP3-mCherry-sensor maakt gelijktijdige real-time metingen van calciumconcentraties en de status van de acrosomale inhoud in levend sperma onder fysiologische omstandigheden mogelijk met behulp van microscopie en een eencellig afgiftesysteem voor stimulerende middelen (Figuur 1). Als onderdeel van de acrosomale matrix zouden membraanfusie en AE resulteren in het verlies van de fotostabiele en pH-ongevoelige mCherry-fluorescentie uit het sperma, aangezien dit eiwit uit het acrosoomblaasje diffundeert. In dit opzicht is het vermogen van het model om de timing en het optreden van AE weer te geven vergelijkbaar met de voordelen van de acrosoomgerichte GFP-muislijn 7,8,9.
De GCaMP3-variant die in deze transgene muizenlijn wordt gebruikt, heeft een geschatte KD van 400 μM en een dynamisch bereik voor Ca2+ van 10-4-10-3 M10, wat geschikt is voor dit blaasje. We toonden aan dat deze combinatie van kenmerken van GCaMP3 de vorming van fusieporiën tussen het plasmamembraan en het buitenste acrosomale membraan (OAM)2 kon onthullen. De detectie van fusieporiën is het gevolg van het feit dat de poriegrootte te klein is om het AcroSensE-eiwit uit het acrosoom te laten dispergeren (via verlies van acrosoomgehalte) en tegelijkertijd een membraankanaal te bieden dat de instroom van Ca2+-ionen in het acrosoomlumen mogelijk maakt, wat leidt tot een toename van de fluorescentie-intensiteit van het GCaMP3.
Het heldere, monomeer, niet-calciumgevoelige fluorescerende eiwit mCherry ondersteunt de visualisatie van het acrosoom terwijl het GCaMP3-signaal zwak is (bijv. voorafgaand aan Ca2+ -binding, Figuur 2), en belangrijker nog, het maakt ook de identificatie mogelijk van acrosoom-intacte zaadcellen die geschikt zijn voor beeldvorming.
Het volgende protocol beschrijft het gebruik van het unieke AcroSensE-muismodel en de methoden voor microscopie die experimenteel worden gebruikt om de dynamiek van AE en spermacalcium met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een op microscopie gebaseerde methode beschreven om het nieuw gegenereerde AcroSensE-muismodel te gebruiken voor real-time, single-cell monitoring en analyse van het samenspel tussen acrosomale calciumdynamiek en tussenstappen die leiden tot AE. Samen met direct beschikbare genetische benaderingen, zoals kruising met andere genetische muismodellen of genbewerking, bieden dit model en deze methode een krachtig systeem om de rol te bestuderen van verschillende componenten en routes die deelnemen aan spermasignal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies R01-HD093827 en R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
