生きたマウス精子における先体カルシウム動態とエキソサイトーシスのリアルタイムイメージング

精子は、受精能力1と呼ばれるプロセス中に受精する能力を獲得し^ます。このプロセスの1つのエンドポイントは、精子がAEを受ける能力を獲得することです。20年以上にわたるデータは、哺乳類の精子におけるAEの複雑で多段階的なモデルの存在を支持しています(^2,3に要約)。しかしながら、生精子におけるAEの研究は困難であり、このプロセスを適切な分解能でモニターするために現在利用可能な方法は、煩雑であり、複数の調製ステップ⁴を必要とし、AEの最終ステップの検出に限定され(例えば、PNA⁵を使用)、細胞質カルシウムの変化の測定に限定される(先体カルシウム動態とは対照的に)、 または、細胞質カルシウム動態または AE⁶ のいずれかの測定に限定されます。

生理学的条件下でのリアルタイムAE研究のいくつかの重要な制限を克服し、カルシウム動態とAEの相互作用の調査を可能にするために、独自のマウスモデルを作成しました。このマウスモデルでは、遺伝的にコードされた^Ca2+センサー(GCaMP3)とmCherryからなる融合タンパク質が発現し、アクロシンプロモーターとシグナル伝達ペプチド2を用いて先体に標的化^{されます。}ターゲットデュアルGCaMP3-mCherryセンサーは、顕微鏡検査と単一細胞刺激剤送達システムを使用して、生理学的条件下で生精子中のカルシウム濃度と先体内容物の状態を同時にリアルタイムに測定することを可能にします(図1)。アクロソームマトリックスの成分として、膜融合、およびAEは、このタンパク質が先体小胞から拡散するため、精子からの光安定性とpH非感受性のないmCherry蛍光の損失をもたらします。この点で、AEのタイミングと発生を反映するモデルの能力は、先体標的GFPマウス系統^の利点に類似しています^7,8,9。

このトランスジェニックマウス系統で用いられているGCaMP3変異体は、KDが約400μMで、Ca²⁺のダイナミックレンジが10-4-10-3 M ¹⁰であり、この小胞に適している。我々は、GCaMP3の特徴の組み合わせにより、原形質膜と外先体膜(OAM⁾²の間の融合孔形成を明らかにすることができることを示しました。融合細孔の検出は、細孔径が小さすぎてAcroSensEタンパク質が先体外に分散し(先体含有量の喪失を介して)、Ca²⁺イオンの先体内腔への流入を可能にする膜「チャネル」を提供し、GCaMP3の蛍光強度を増加させる結果です。

明るく、単量体で、カルシウム感受性のない蛍光タンパク質mCherryは、GCaMP3シグナルが微弱な間(例えば、Ca²⁺ 結合前、 図2)の先体可視化をサポートし、重要なことに、イメージングに適した先体無傷の精子細胞の同定も可能にします。

以下のプロトコルでは、独自のAcroSensEマウスモデルの利用と、高い空間分解能と時間分解能でAEおよび精子カルシウムの動態を研究するために実験的に使用された顕微鏡検査法について説明します。