Микроядерный анализ криоконсервированной цельной крови

Для этого исследования образцы крови были собраны методом венепункции у 30 здоровых доноров в возрасте от 17 до 65 лет. Данные МН от 20 доноров были повторно использованы из статьи Beyls et al.8 Сбор образцов крови осуществляется в соответствии с рекомендациями Комитета по этике Университетской больницы Гента (регистрационный номер: 2019/1565), Бельгия. От всех участников было получено письменное информированное согласие. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и реагентами, используемыми в этом протоколе. 1. Забор образцов крови Перед началом работы убедитесь в наличии письменного информированного согласия участников и надлежащем соблюдении этических норм. Соберите кровь в пробирки с литий-гепарином и храните при комнатной температуре до тех пор, пока не будете готовы к переработке для криоконсервации. 2. Криоконсервация цельной крови ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы до забора клеток выполняются асептически в стерильном ламинарном потоке воздуха. Чтобы криоконсервировать 1 мл крови, сделайте 1 мл замораживающей среды, смешав 800 мкл фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO).ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживающая среда готовится в объеме, равном образцам крови, которые необходимо заморозить. Для криоконсервации цельной крови переложите образец крови из гепаринизированной пробирки в центрифужные пробирки объемом 15 или 50 млПРИМЕЧАНИЕ: Емкость пробирки зависит от объема крови. Встряхните кровь на низкой скорости с непрерывным, но капельным добавлением равного объема замораживающей среды. Перелейте 2 мл смеси для замораживания крови в криовиалы (2 мл), где каждая аликвота содержит 1 мл образца крови, смешанного с 1 мл замораживающей смеси. Ступенчатое постепенное замораживаниеПереложите криовиалы в криобокс, содержащий изопропанол, и поместите в морозильную камеру (-80 °C) на ночь. Переведите криовиалы в жидкий азот для длительного использования. 3. Размораживание криоконсервированной крови ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ограничить общее время процесса размораживания, одновременно следует обрабатывать не более 8 криовиалов (по 2 мл каждый). ПодготовкаПеред размораживанием крови разогрейте 200 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) до 37 °C. Готовят рабочий раствор необходимой питательной среды в стерильных условиях. Убедитесь, что среда на культуру включает 1,6 мл полной среды: среда Мемориального института Роузвелл-Парк (RPMI) с добавлением пенициллина/стрептомицина (0,5%), 0,2 мл FCS, 20 мкл пирувата натрия и 2 мкл β-меркаптоэтанола.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку при размораживании может быть потеряно значительное количество клеток крови, размороженную кровь культивируют в небольших лунках, таких как 24-луночные планшеты общим объемом 2 мл. Используется одна многолуночная пластина на дозу. Для каждой лунки для посева укажите на крышке код донора и A/B, а также дату и дозу, как указано ниже (рис. 1). Рисунок 1: Предлагаемая схема 24-луночного планшета для культивирования цельной крови для анализа микроядер. Разметьте лунки и укажите коды доноров в соответствующих местах на крышке. Для каждого образца пациента дубликаты лунок должны быть примыкать друг к другу. Обратите внимание, что это наводящая на размышления компоновка для коллиматора 10 x 10 и может быть изменена в зависимости от размера коллиматора или образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Этапы размораживания и культивирования цельной кровиПодогрейте водяную баню до 37 °C. Извлеките необходимые криовиалы из жидкого азота (количество зависит от требований, таких как количество доз).ПРИМЕЧАНИЕ: Один криовиал содержит 1 мл крови и 1 мл замораживающей среды. Таким образом, можно установить две культуры с кровью из одного криовиала. Частично разморозьте криовиалы на теплой водяной бане (до тех пор, пока не будут видны мелкие кристаллы льда). Выньте флаконы с водяной бани и очистите флаконы снаружи стерильной папиросной бумагой. В стерильном ламинарном колпаке открывайте флаконы очень медленно, чтобы предотвратить выливание пузырьков воздуха, образовавшихся внутри пробирок. Повторно суспендируйте содержимое каждого флакона и по отдельности переложите его в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл (по 1 пробирке на флакон). Добавьте в соответствующие пробирки по каплям 1 мл теплого (37 °C) PBS, осторожно вкручивая пробирку. Ресуспендируйте с помощью пипетки P1000. Для разбавления и равномерной стирки добавьте по каплям 7 мл предварительно подогретого PBS (37 °C) и повторно взвесьте пипеткой P1000. Центрифугируют кровь в течение 8 мин при 180 × г (с установкой на ускорение 1, тормоз 1) при комнатной температуре. На этом этапе ожидания заполните пустые лунки (кроме той, где будут культивироваться клетки) 500 мкл PBS. Поместите пластины лунки обратно в инкубатор для предварительного прогрева. После завершения центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость, оставив примерно 1 мл, чтобы не повредить клеточную гранулу. Повторно суспендируйте гранулу в оставшейся надосадочной жидкости с помощью пипетки P1000. Добавьте по каплям 8 мл теплого PBS (37 °C) в соответствующие пробирки, осторожно встряхивая пробирки. После этого ресуспендируйте с помощью пипетки P1000. Центрифугируют ресуспендированную кровь в течение 8 мин при 180 × г (с установкой на ускорение 9, тормоз 9). На этом этапе ожидания перенесите 200 мкл питательной среды в каждую из отмеченных лунок. Храните планшеты обратно в инкубатор при температуре 37 °C. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость непрерывным движением (чтобы не повредить гранулы с сыпучими клетками), но оставьте около 80 мкл надосадочной жидкости. К грануле добавляют 280 мкл FCS (комнатной температуры) и ресуспендируют (до общего объема 360 мкл). Перенесите 180 мкл клеточной суспензии в каждую лунку и ресуспендируйте (= 0,5 мл «крови»/культуры). Общий объем в каждой лунке теперь составляет 380 мкл, в результате чего получается средний слой толщиной 2 мм. Перед облучением инкубируют планшеты в инкубатореCO2 при температуре 37 °C не менее 10 мин. 4. Проба G0 MN Выньте планшеты из инкубатора и облучите клеточную культуру необходимыми дозами, такими как рентгеновские лучи 0,5, 1 и 2 Гр (220 кВ, 13 мА, 0,15 мм Cu) при комнатной температуре. Используйте бутафорские облученные образцы в качестве контроля для выявления спонтанных выходов МН. Сразу после облучения добавьте в каждую лунку по 1,62 мл питательной среды (37 °С). Чтобы стимулировать деление клеток в Т-лимфоцитах, добавьте 40 мкл фитогемагглютинина (PHA) в каждую лунку и тщательно ресуспендируйте. Поместите эти планшеты обратно в инкубатор (5% CO2, 37 °C).ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет время начала анализа. Заблокируйте цитокинез через 23 ч после стимуляции, добавив 8 мкл цитохалазина B (6 мкг/мл) на лунку, и ресуспендируйте должным образом. Соберите клеточные культуры через 70 часов после стимуляции/посева. Ресуспендируйте и перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл. Промойте каждую лунку 2 мл PBS и добавьте этот PBS в соответствующую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют пробирки в течение 8 мин при 180 × г при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, но оставьте примерно 500 мкл на гранулу. Взбейте гранулу (на полной скорости) и во время вихря медленно добавьте по каплям 2 мл холодного хлорида калия (KCl, 4 °C). Немедленно центрифугируют клетки при 180 × г в течение 8 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, оставив примерно 500 мкл надосадочной жидкости. Вмешайте гранулу (на полной скорости) и во время вихря медленно добавьте по каплям 2 мл холодного фиксатора 1 (раствор метанола/уксусной кислоты/Рингера в соотношении 4:1:5). Оставьте пробирки с образцами на ночь при температуре 4 °C (минимум 12 ч и максимум 96 ч). Центрифугу в течение 8 мин при 180 × г. Выбросьте надосадочную жидкость. Встряхните гранулу (на полной скорости) и во время вихря медленно добавьте по каплям 2 мл холодного фиксатора 2 (метанол/уксусная кислота в соотношении 4:1). Центрифугу в течение 8 мин при 180 × г. Выбросьте надосадочную жидкость. Вбейте гранулу (на полной скорости), а затем медленно (по каплям), во время перевешивания, добавьте в гранулу 2 мл холодного фиксатора 2 . Оставьте пробирки с образцами при температуре 4 °C (минимум 12 ч и максимум 96 ч). Очистите предметные стекла изопропанолом и наклейте на них надлежащую маркировку.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте напечатанные наклейки для маркировки, так как чернила маркера легко стираются во время обработки. Центрифугируют пробирки с образцами в течение 8 мин при 180 × г. Перелейте надосадочную жидкость в другую пробирку, чтобы сконцентрировать клетки в соответствии с размером гранулы. Вбейте гранулу. Капните 40 мкл неподвижных клеток на сухое и чистое предметное стекло. Дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре. Храните предметные стекла в коробке или морилке сразу для наблюдения. 5. Окрашивание акридиновым оранжевым (АО) Погрузите предметные стекла в краситель АО на 1 минуту, после чего быстро промойте их в дистиллированной воде, а затем поместите предметные стекла в фосфатный буфер (pH 6,8) на 1 минуту. Выньте предметные стекла из буферного раствора и чистой папиросной бумагой высушите обратную сторону предметных стекол и положите предметные стекла на чистую папиросную бумагу. Капните 20 мкл фосфатного буфера на предметное стекло и аккуратно накройте его чистым покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. Запечатайте эти предметные стекла силиконовым цементом.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку AO чувствителен к свету и со временем тускнеет, для хорошего контраста и флуоресценции рекомендуется сделать надрезы на предметных стеклах в течение 5 дней после окрашивания. Всегда храните предметные стекла в холодном помещении (4 °C), когда они не исследуются. 6. Подрезка окрашенных предметных стекол Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп и исследуйте 1000 двуядерных клеток (BN). Вручную подсчитайте МН, которые являются одним из шести биомаркеров токсичности. Для этого попросите двух независимых экспертов изучить 500 BN-клеток на предметное стекло при одинаковом увеличении.ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены некоторые основные критерии оценки, рекомендованные Fenech для оценки окрашенных слайдов9Выберите клетку BN, посмотрев на красиво округлые клетки с неповрежденной цитоплазмой, с двумя хорошо различимыми ядрами примерно одинакового размера, правильной формы и окрашивания. Убедитесь, что цитоплазма клетки BN отличается от цитоплазмы соседней клетки. Оцените МН, отметив, что оно морфологически идентично основным ядрам, но меньше их; даже самая большая МН не может быть больше 1/3 диаметра основных ядер. Балл МН можно получить только в том случае, если он не касается основных ядер или, по крайней мере, граница микроядер отличается от границы основных ядер.