مقايسة النواة الدقيقة على الدم الكامل المحفوظ بالتبريد
Summary
نقدم هنا بروتوكولا محسنا لمقايسة النواة الدقيقة المكونة من كتلة السيتوكينات على عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد. هذه الطريقة المثلى للحفظ بالتبريد للدم الكامل لتحليل النواة الدقيقة هي تقنية موثوقة لأخذ العينات على نطاق واسع والدراسات متعددة المراكز ويمكن استخدامها في المقايسات الأخرى المتعلقة بالدم أيضا.
Abstract
مقايسة النواة الدقيقة في كتلة السيتوكينات في المختبر (CBMN) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع في أبحاث البيولوجيا الإشعاعية ، وقياس الجرعات البيولوجية ، ودراسات السمية الجينية ، واختبار الحساسية الإشعاعية في المختبر . تعتمد هذه الطريقة الوراثية الخلوية على اكتشاف النوى الدقيقة في الخلايا ثنائية النواة الناتجة عن شظايا الكروموسومات المتخلفة أثناء انقسام الخلايا. عينات الدم الكاملة الطازجة هي أكثر أنواع العينات المفضلة لفحص CBMN. ومع ذلك ، فإن عيوب العمل مع عينات الدم الطازجة تشمل المعالجة الفورية بعد جمع الدم والعدد المحدود من التحليلات المتكررة التي يمكن إجراؤها دون أخذ عينات دم إضافية.
نظرا لأن الحاجة إلى عينات دم جديدة يمكن أن تكون صعبة من الناحية اللوجستية ، فإن مقايسة CBMN على عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد ستكون ذات فائدة كبيرة ، خاصة في دراسات المرضى واسعة النطاق. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتجميد عينات الدم الكاملة وإجراء فحص CBMN على عينات الدم المجمدة هذه. تم تجميد عينات الدم من المتطوعين الأصحاء وإذابتها في نقاط زمنية مختلفة ثم إخضاعها لبروتوكول فحص النواة الدقيقة المعدل. توضح النتائج أن هذا الإجراء الأمثل يسمح بأداء مقايسة CBMN على عينات الدم المجمدة. قد يكون بروتوكول الحفظ بالتبريد الموصوف مفيدا جدا أيضا للمقايسات الوراثية الخلوية الأخرى ومجموعة متنوعة من المقايسات الوظيفية التي تتطلب تكاثر الخلايا الليمفاوية.
Introduction
منذ اكتشافه ، كان استخدام الإشعاع المؤين (IR) موضع نقاش بين الباحثين بسبب آثاره الضارة على الكائنات الحية. عادة ما يتجلى التأثير الضار من خلال تلف الحمض النووي مثل الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل (DSBs) ، ويؤدي الفشل في إصلاح هذه DSBs إلى انحرافات وطفرات كروموسومية ، وهي سمات مميزة مهمة للسرطان 1,2. يمكن فحص هذه الانحرافات الكروموسومية بواسطة المقايسات الخلوية مثل مقايسة النواة الدقيقة لكتلة السيتوكينات (CBMN). النوى الدقيقة هي شظايا كروموسومية متخلفة لا يمكن دمجها في النوى البنوية، ومن ثم تترك وراءها أثناء الانقسام الميتوزي.
CBMN هي تقنية وراثية خلوية شائعة الاستخدام وموثوقة لتقييم تلف الكروموسومات لدى الأفراد المعرضين للإشعاع المؤين في الجسم الحي أو في المختبر. يمكن استخدام الدم الكامل الطازج أو خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة (PBMCs) في اختبار CBMN. الدم الكامل الطازج هو في الغالب المادة البيولوجية المفضلة لأن عزل ومعالجة PBMCs يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ويرافقه فقدان بلازما المصل التي تعمل كوسيط داعم لبقاء الخلايا ونموها. لتحقيق محصول جيد من الخلايا ثنائية النواة ، يجب معالجة الدم الكامل الطازج مباشرة بعد جمعه. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الحاجة إلى المعالجة الفورية صعبة من الناحية اللوجستية أثناء ضيق الوقت. علاوة على ذلك ، عندما يفترض الحصول على العديد من العينات على مدى فترة طويلة أو جمعها في نقاط بعيدة عن مراكز المعالجة ، يمكن أن يكون تخزين عينات الدم الطازجة عاملا مقيدا 3,4.
علاوة على ذلك ، للسماح بتحليل MN المتكرر في نفس الفرد / المريض ، سيكون تجميد عينات الدم مفيدا. تتمثل إحدى طرق تخزين الخلايا الليمفاوية للتطبيق اللاحق لمقايسة CBMN في تجميد PBMCsالمعزولة 5,6. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية عدة خطوات معالجة قبل تجميد PBMCs. لذلك ، فإن الحفظ بالتبريد للدم الكامل سيمثل بديلا بسيطا وفعالا من حيث الوقت للحفظ بالتبريد ل PBMCs المعزولة. لا يتوفر سوى القليل من المعلومات المتعلقة باستخدام الدم الكامل المجمد للمقايسات الوراثية الخلوية أو المقايسات التي تتطلب تكاثر الخلايا الليمفاوية. تشير ورقة واحدة فقط إلى استخدام الدم الكامل المحفوظ بالتبريد لتحليل الطورالاستوائي 7.
نظرا لأن الحفظ بالتبريد للدم الكامل سيوفر العديد من المزايا في مجال المراقبة الحيوية وقياس الجرعات الحيوية وتقييم الحساسية الإشعاعية ، فقد قامت مجموعتنا بتحسين بروتوكول الحفظ بالتبريد للدم الكامل الذي يسمح بتطبيق اختبار CBMN8. لقد أثبتنا أن الخلايا الليمفاوية الموجودة في مزارع الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد تحتفظ بسلامتها الجينومية وقدرتها على الانتشار لمدة 1 سنة على الأقل. في ورقة الطرق هذه ، نصف بالتفصيل إجراء الحفظ بالتبريد وبروتوكول فحص CBMN ، والذي تم تحسينه بواسطة Beyls et al.8 ، والإبلاغ عن النتائج التي تم الحصول عليها لعينات الدم المجمدة ل 30 فردا سليما. بالنسبة لفحص CBMN ، تم تشعيع مزارع الدم في المختبر بجرعات 0.5 و 1 و 2 Gy لتقييم استجابة MN في الخلايا الليمفاوية لعينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعدل لتطبيق مقايسة CBMN هو وسيلة سهلة ومريحة نسبيا لتخزين عينات الدم بكميات كبيرة. يحدد الإجراء كل التفاصيل الدقيقة ولكن المهمة التي يجب الاهتمام بها أثناء الحفظ بالتبريد وفحص CBMN. تستخدم بروتوكولات المختبر الأخرى عادة 10٪ DMSO في خليط التجميد ، بينما يحتوي خليط التجميد لدينا على 20٪ DMSO جنبا إلى جنب مع 80٪ FCS7. نظرا لأن خليط التجميد هذا يضاف بأحجام متساوية إلى عينة الدم الكاملة ، فإن التركيز النهائي هو أيضا 10٪ DMSO. لتحسين معدل بقاء الخلية وتحفيز انقسام الخلايا ، نضيف 1٪ بيروفات الصوديوم و 0.1٪ بيتا ميركابتوإيثانول إلى وسط الاستزراع الكامل (cRPMI). هذا يتوافق مع بروتوكول زراعة الخلايا الذي وضعته مجموعتنا البحثية 6,8.
على الرغم من أن مشكلة تكتل الخلايا أثناء الذوبان لا يمكن حلها بالكامل في هذا البروتوكول ، إلا أن فصل الخلايا كان أفضل من البروتوكولات التقليدية الأخرى. بدلا من الإضافة المتسقة والمفاجئة لوسائط الاستزراع لاستعادة الخلايا بعد الذوبان ، حصلنا على نتائج أفضل عند إضافة PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بالتنقيط أثناء خطوات الغسيل. يساعد هذا التحسن في تقليل الإجهاد الخلوي ويقلل من التكتل مع استعادة عالية مثبتة للخلايا. علاوة على ذلك ، لا يمكن ملاحظة أي اختلاف واضح في صلاحية الخلية عند استخدام PBS عبر RPMI. تم التحقق من صحة المجموعة من أن طول فترة الحفظ بالتبريد (حتى 1 سنة) لن يؤثر على غلة MN ، سواء في العينات المشععة وغير المشععة 6,8. تشير الدراسات إلى أنه يمكن تحقيق قابلية جيدة للخلايا وتكاثر PBMCs من خلال التجميد التدريجي عند درجات حرارة منخفضة (النيتروجين السائل) ، تليها الإضافة التدريجية للوسط المسخن مسبقا أثناء إذابة10,11. أظهر الباحثون أن المجموعات الفرعية للخلايا اللمفاوية التائية في الدم الكامل المذاب قابلة للمقارنة مع تلك التي لوحظت في PBMCsالمذابة 12. علاوة على ذلك ، ثبت أن الأنواع الفرعية للخلايا المستردة من عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد تشبه تلك التي لوحظت في عينات الدم الكاملة الطازجة13,14.
إذا قمنا بفحص النتائج الإرشادية التي تم الحصول عليها في التقرير ، فإننا نرى أن الزيادة التربيعية الخطية مع الجرعة (الشكل 3) تتفق مع تقارير الأدبيات الأخرى حول النوى الدقيقة التي يسببها نقل الطاقة الخطي (LET)15,16. التباين في غلة MN التي لوحظت في عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد (الجدول 1) في نطاق مع التباين المبلغ عنه لمزارع الدم الكامل الطازجة8،17،18. تم التحقق من صحة البروتوكول الموصوف بالتفصيل هنا على دم كامل طازج ومحفوظ بالتبريد ل 20 متطوعا سليما8. كان مؤشر الانقسام النووي (NDI) ، وهو معلمة مهمة لتكاثر الخلايا لوحظ في هذا التقرير8 ، متفقا مع المؤشر المقترح للدم الكامل الطازج19,20. مجتمعة ، يوفر هذا البروتوكول الأمثل للحفظ بالتبريد للدم الكامل ومقايسة النواة الدقيقة المعدلة إنتاجية أفضل للخلايا ، وبالتالي ، يوصى بتكييف هذا البروتوكول لتقييم الحساسية الإشعاعية. نظرا لأن قابلية استنساخ البروتوكول قد تم التحقق منها بالفعل8 ، يقترح أن يكون قابلا للتطبيق في الدراسات واسعة النطاق ومتعددة المراكز.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا L. Pieters و T. Thiron و G. De Smet على دعمهم الفني. نحن ممتنون لجميع المتطوعين الذين تبرعوا بالدم للدراسة. تم دعم العمل ماليا من قبل مؤسسة الأبحاث – فلاندرز (FWO) بموجب منحة (T000118N).
Materials
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
| 24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
| 96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
| Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
| Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
| CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
| cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
| Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
| Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
| Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
| Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
| Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
| GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
| KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
| KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
| Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
| Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
| Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
| NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
| Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
| Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
| Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
| RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
| Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
| Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
| β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |
References
- Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors. Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).
- Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. Radiation-induced cell death and its mechanisms. Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).
- Roederer, M., et al. The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis. Cell. 161 (2), 387-403 (2015).
- Bankoglu, E. E., et al. Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay. Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).
- Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method. Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).
- Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells. Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125 (2020).
- Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies. Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).
- Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood. International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Ramachandran, H., et al. Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies. Cells. 1 (3), 313-324 (2012).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).
- Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).
- Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).
- Braudeau, C., et al. An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).
- Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response. Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).
- Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure. Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).
- Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability. Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).
- Pajic, J., et al. Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays. Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).
- Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).
- Miszczyk, J., Rawojć, K. Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation. International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).
