凍結保存された全血の小核アッセイ

この研究では、17歳から65歳までの30人の健康なドナーから静脈穿刺によって血液サンプルが採取されました。20人のドナーからのMNデータは、Beylsらの論文から再利用されました8血液 サンプルの収集は、ベルギーのゲント大学病院の倫理委員会(登録番号:2019/1565)のガイドラインに従っています。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。 1.血液サンプルの採取 開始する前に、参加者の書面によるインフォームドコンセントが利用可能であり、倫理ガイドラインが適切に守られていることを確認してください。 血液をLi-ヘパリンチューブに採取し、凍結保存用の処理の準備が整うまで室温で保存します。 2.全血の凍結保存 注:細胞回収までのすべてのステップは、滅菌層流中で無菌的に行われます。 1 mLの血液を凍結保存するには、800 μLのウシ胎児血清(FCS)と200 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を混合して、1 mLの凍結培地を作ります。注:凍結培地は、凍結する必要がある血液サンプルに等しい量で調製されます。 全血の凍結保存には、血液サンプルをヘパリン処理チューブから15mLまたは50mLの遠心分離チューブに移します注意: チューブの容量は血液の量によって異なります。 同量の凍結培地を連続的ではあるが 滴下して 、低速で血液を渦巻きさせます。 2 mL の血液凍結混合物をクライオバイアル (2 mL) に移し、各アリコートに 1 mL の血液サンプルと 1 mL の凍結混合物を混合します。 段階的な段階的凍結クライオバイアルをイソプロパノールの入ったクライオボックスに移し、冷凍庫(-80°C)で一晩置きます。 クライオバイアルを液体窒素に移し、長期間使用してください。 3. 凍結保存血液の融解 注:解凍プロセスの合計時間を制限するには、一度に最大8つのクライオバイアル(各2 mL)を処理する必要があります。 準備血液を解凍する前に、200 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cに予温します。 無菌条件下で必要な培地の作業溶液を調製します。培養あたりの培地には、ペニシリン/ストレプトマイシン(0.5%)、0.2 mL の FCS、20 μL のピルビン酸ナトリウム、2 μL の β-メルカプトエタノールを添加した Rosewell Park Memorial Institute(RPMI)培地)が 1.6 mL の完全培地が含まれていることを確認します。注:解凍中にかなりの数の血球が失われる可能性があるため、融解した血液は、総容量2 mLの24ウェルプレートなどの小さなウェルで培養されます。1回の投与につき1枚のマルチウェルプレートを使用します。 各培養ウェルについて、以下に提案されているように、ドナーコードとA/Bを日付と用量とともに蓋に示します(図1)。 図1:小核アッセイのために全血を培養するための24ウェルプレートの推奨レイアウト。 ウェルに印を付け、蓋の適切な場所にドナーコードを示します。各患者サンプルについて、重複するウェルは互いに隣接している必要があります。これは 10 x 10 コリメータの推奨レイアウトであり、コリメータまたはサンプルのサイズに応じて変更できることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 全血の解凍と培養の手順ウォーターバスを37°Cに温めます。 液体窒素から必要なクライオバイアルを取り出します(数は投与回数などの要件によって異なります)。注:1つのクライオバイアルには、1 mLの血液と1 mLの凍結培地が含まれています。したがって、1つのクライオバイアルからの血液で2つの培養をセットアップできます。 温水浴でクライオバイアルを部分的に解凍します(小さな氷の結晶が見られるまで)。 水浴からバイアルを取り出し、バイアルの外側を滅菌ティッシュペーパーで洗浄します。 滅菌層流フードでは、チューブ内に形成された気泡がこぼれないように、バイアルを非常にゆっくりと開きます。 各バイアルの内容物を再懸濁し、個別に15 mLのコニカル遠心チューブ(バイアルあたり1チューブ)に移します。 それぞれのチューブに、チューブを静かに旋回させながら、1 mLの温かい(37°C)PBSを滴下します。P1000ピペットで再懸濁します。 希釈して均一に洗浄するには、予熱したPBS(37°C)を7 mL滴下し、P1000ピペットで再懸濁します。 室温で180 × g ( 加速度1、ブレーキ1で設定)で8分間血液を遠心分離します。 この待機ステップでは、空のウェル(細胞を培養するウェル以外)に500 μLのPBSを充填します。 ウェルプレートをインキュベーターに戻し、予熱します。 遠心分離が完了したら、細胞ペレットを乱さないように約1 mLを残して上清を慎重に除去します。 残りの上清にペレットをP1000ピペットで再懸濁します。 8 mLの温かいPBS(37°C)を各チューブに滴下し、チューブを静かに旋回させます。その後、P1000ピペットで再懸濁します。 再懸濁した血液を180 × g で8分間遠心分離します( 加速度9、ブレーキ9で設定)。 この待機ステップ中に、200 μLの培地をマークされた各ウェルに移します。 プレートをインキュベーターに戻し、37°Cのままにします。 遠心分離後、上清を連続的に除去しますが(緩い細胞ペレットを乱さないようにするため)、約80 μLの上清を残します。 ペレットに280μLのFCS(室温)を加え、再懸濁します(総量360μLになる)。 180 μLの細胞懸濁液を各ウェルに移し、再懸濁します(=0.5 mLの「血液」/培養液)。各ウェルの総容量は 380 μL になり、2 mm の中層になります。 照射前に、37°CのCO2 インキュベーターで少なくとも10分間プレートをインキュベートします。 4. G0 MNアッセイ インキュベーターからプレートを取り出し、室温で0.5、1、2GyのX線(220kV、13mA、0.15mmCu)などの必要線量を細胞培養物に照射します。偽照射サンプルをコントロールとして使用して、自発的な MN 収量を同定します。 照射後すぐに、各ウェルに培地(37°C)1.62mLを添加します。 Tリンパ球の細胞分裂を刺激するには、各ウェルに40 μLのフィトヘマグルチニン(PHA)を添加し、完全に再懸濁します。 これらのプレートをインキュベーター(5%CO2、37°C)に戻します。注:これはアッセイ の開始時間 になります。 ウェルあたり8 μLのサイトカラシンB(6 μg/mL)を添加して、刺激の23時間後に細胞質分裂をブロックし、適切に再懸濁します。 刺激/培養時間の70時間後に細胞培養を回収します。細胞を再懸濁し、15 mLチューブに移します。各ウェルを 2 mL の PBS で洗浄し、この PBS をそれぞれの 15 mL チューブに加えます。 チューブを室温で180 × gで8分間遠心分離します。 上清を捨てますが、ペレットの上に約500μLを残します。 ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの冷たい塩化カリウム(KCl、4°C)をゆっくりと滴下します。 直ちに細胞を180 × g で8分間遠心分離します。 上澄み液を廃棄し、約500μLの上清を残します。 ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの低温 固定液1 (メタノール/酢酸/リンゲル溶液を4:1:5の比率で)ゆっくりと滴下します。 サンプルチューブを4°Cで一晩放置します(最小12時間、最大96時間)。 180 × gで8分間遠心分離します。 上澄みを捨てます。 ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの低温 固定液2 (メタノール/酢酸を4:1の比率で)をゆっくりと滴下します。 180 × gで8分間遠心分離します。 上澄みを捨てます。 ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの低温 固定液2 をペレットにゆっくりと(滴下して)加えます。 サンプルチューブは4°C(最小12時間、最大96時間)に置いておきます。 スライドをイソプロパノールで洗浄し、適切にラベル付けします。注意: マーカーインクは処理中に簡単に拭き取ることができるため、印刷されたステッカーを使用してラベルを付けます。 サンプルチューブを180 × gで8分間遠心分離します。 上清を別のチューブに移し、ペレットのサイズに合わせて細胞を濃縮します。 ペレットをボルテックスします。 固定細胞40 μLを乾いた清潔なスライドに滴下します。 スライドを室温で乾燥させます。スライドは箱に保管するか、すぐに染色して観察してください。 5. アクリジンオレンジ(AO)染色 スライドをAO染色液に1分間浸し、続いて蒸留水で素早く洗浄し、次にスライドをリン酸緩衝液(pH 6.8)に1分間入れます。 緩衝液からスライドを取り出し、清潔なティッシュペーパーでスライドの裏側を乾かし、清潔なティッシュペーパーの上にスライドを置きます。 20 μLのリン酸緩衝液をスライドの上に落とし、気泡を避けながら清潔なカバーガラスでそっと覆います。 これらのスライドをシリコーンセメントで密封します。注:AOは感光性があり、時間の経過とともに退色するため、良好なコントラストと蛍光のために、染色後5日以内にスライドのスコアリングを行うことをお勧めします。スライドを検査しないときは、必ず冷蔵室(4°C)に保管してください。 6. 染色されたスライドの採点 スライドを蛍光顕微鏡の下に置き、1,000個の二核細胞(BN)を調べます。毒性の6つのバイオマーカーの1つであるMNを手動でカウントします。そのためには、2人の独立したスコアラーに、同じ倍率で500個のBN細胞/スライドを調べてもらいます。注:以下は、染色されたスライド9を採点するためにFenechが推奨する採点基準のいくつかのハイライトですほぼ同じサイズ、規則的な形状、染色パターンの2つのよく区別された核を持つ、無傷の細胞質を持つきれいに丸みを帯びた細胞を探して、BN細胞を選択します。BN細胞の細胞質が隣接する細胞の細胞質と区別できることを確認してください。 MNをスコアリングし、形態学的に主核と同じであるが、主核よりも小さいことに注意します。最大のMNでさえ、主核の直径の1/3を超えることはできません。MNは、主核に触れていないか、少なくとも微小核の境界が主核の境界と区別できる場合にのみスコアリングします。