De micronucleustest op gecryopreserveerd volbloed

Voor dit onderzoek werden bloedmonsters verzameld door middel van venapunctie van 30 gezonde donoren tussen 17 en 65 jaar. MN-gegevens van 20 donoren werden hergebruikt uit het artikel van Beyls et al.8 De afname van de bloedstalen gebeurt volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie van het Universitair Ziekenhuis Gent (registratienummer:2019/1565), België. Van alle deelnemers werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt. 1. Afname van bloedmonsters Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat schriftelijke geïnformeerde toestemming van de deelnemers beschikbaar is en dat ethische richtlijnen correct worden gevolgd. Verzamel bloed in Li-Heparine-buisjes en bewaar het bij kamertemperatuur totdat het klaar is voor verwerking voor cryopreservatie. 2. Cryopreservatie van volbloed OPMERKING: Alle stappen tot het oogsten van cellen worden aseptisch uitgevoerd in een steriele laminaire luchtstroom. Om 1 ml bloed te cryopreservatie, maakt u 1 ml vriesmedium door 800 μL foetaal kalfsserum (FCS) en 200 μl dimethylsulfoxide (DMSO) te mengen.OPMERKING: Het vriesmedium wordt bereid in een volume dat gelijk is aan de bloedmonsters die moeten worden ingevroren. Voor cryopreservatie van volbloed brengt u het bloedmonster over van de gehepariniseerde buis naar centrifugebuisjes van 15 of 50 mlOPMERKING: De capaciteit van het buisje is afhankelijk van het volume van het bloed. Draai het bloed met lage snelheid met continue maar druppelsgewijze toevoeging van een gelijk volume vriesmedium. Breng 2 ml bloedbevriezingsmengsel over in cryovials (2 ml) waarbij elk aliquot 1 ml bloedmonster gemengd met 1 ml vriesmengsel bevat. Stapsgewijs geleidelijk invriezenBreng cryovials over in een cryobox met isopropanol en zet ze een nacht in de vriezer (-80 °C). Breng de cryovials over in vloeibare stikstof voor langdurig gebruik. 3. Ontdooien van gecryopreserveerd bloed NOTITIE: Om de totale tijd van het ontdooiproces te beperken, mogen maximaal 8 cryovials (elk 2 ml) tegelijk worden gehanteerd. VoorbereidingVerwarm 200 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor tot 37 °C voordat het bloed wordt ontdooid. Bereid een werkoplossing van het benodigde kweekmedium onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat het medium per cultuur 1,6 ml compleet medium bevat: media van het Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) aangevuld met penicilline/streptomycine (0,5%), 0,2 ml FCS, 20 μl natriumpyruvaat en 2 μl β-mercaptoethanol.OPMERKING: Aangezien een aanzienlijk aantal bloedcellen verloren kan gaan tijdens het ontdooien, wordt het ontdooide bloed gekweekt in kleine putjes zoals platen met 24 putjes met een totaal volume van 2 ml. Per dosis wordt één plaat met meerdere putjes gebruikt. Vermeld voor elk kweekputje de donorcode en A/B op het deksel, samen met de datum en de dosis, zoals hieronder voorgesteld (figuur 1). Figuur 1: Voorgestelde lay-out van een plaat met 24 putjes om volbloed te kweken voor de micronucleustest. Markeer de putjes en vermeld de donorcodes op de juiste plaatsen op het deksel. Voor elk patiëntmonster moeten dubbele putjes naast elkaar liggen. Merk op dat het een suggestieve lay-out is voor een collimator van 10 x 10 en kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van de collimator of monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Stappen voor het ontdooien en kweken van volbloedVerwarm het waterbad tot 37 °C. Haal de benodigde cryovials uit de vloeibare stikstof (het aantal is afhankelijk van de vereisten zoals het aantal doses).OPMERKING: Een cryovial bevat 1 ml bloed en 1 ml vriesmedium. Daarom kunnen twee culturen worden opgezet met bloed uit één cryovial. Ontdooi de cryovials gedeeltelijk in het warmwaterbad (totdat er nog kleine ijskristallen te zien zijn). Haal de injectieflacons uit het waterbad en reinig de buitenkant van de flacons met steriel tissuepapier. Open in een steriele laminaire luchtstroomkap de injectieflacons zeer langzaam om te voorkomen dat er luchtbellen in de buizen naar buiten lopen. Resuspendeer de inhoud van elke injectieflacon en breng deze afzonderlijk over in een conische centrifugebuis van 15 ml (1 buis per injectieflacon). Voeg druppelsgewijs 1 ml warme (37 °C) PBS toe aan de respectievelijke buisjes terwijl u de buis voorzichtig ronddraait. Resuspendeer met een P1000-pipet. Voeg voor verdunning en gelijkmatig wassen druppelsgewijs 7 ml voorverwarmde PBS (37 °C) toe en resuspendeer met een P1000-pipet. Centrifugeer het bloed gedurende 8 minuten bij 180 × g (met instelling bij versnelling 1, rem 1) bij kamertemperatuur. Vul tijdens deze wachtstap de lege putjes (behalve die waar de cellen worden gekweekt) met 500 μL PBS. Plaats de putplaten terug in de incubator om voor te verwarmen. Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u voorzichtig het supernatant en laat u ongeveer 1 ml achter om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord. Resuspendeer de pellet in het resterende supernatans met een P1000-pipet. Voeg druppelsgewijs 8 ml warme PBS (37 °C) toe aan de respectievelijke buisjes terwijl je de buisjes voorzichtig ronddraait. Resuspendeer daarna met een P1000-pipet. Centrifugeer het geresuspendeerde bloed gedurende 8 minuten bij 180 × g (met instelling bij acceleratie 9, rem 9). Breng tijdens deze wachtstap 200 μL kweekmedium over naar elk van de gemarkeerde putjes. Bewaar de platen terug in de broedstoof om op 37 °C te blijven. Verwijder na het centrifugeren het supernatans in een continue beweging (om verstoring van de losse celpellet te voorkomen), maar laat ongeveer 80 μL van het supernatant achter. Voeg aan de pellet 280 μL FCS (kamertemperatuur) toe en resuspendeer (tot een totaal volume van 360 μL). Breng 180 μL van de celsuspensie over naar elk putje en resuspendeer (= 0,5 ml “bloed”/kweek). Het totale volume in elke put is nu 380 μL, wat resulteert in een medium laag van 2 mm. Incubeer de platen vóór de doorstraling gedurende ten minste 10 minuten in een CO2 -incubator bij 37 °C. 4. G0 MN-test Haal de platen uit de incubator en bestraal de celkweek met de vereiste doses zoals 0,5, 1 en 2 Gy röntgenstralen (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) bij kamertemperatuur. Gebruik schijnbestraalde monsters als controles om spontane MN-opbrengsten te identificeren. Voeg onmiddellijk na de doorstraling 1,62 ml kweekmedium (37 °C) toe aan elk putje. Om de celdeling in T-lymfocyten te stimuleren, voegt u 40 μL fytohemagglutinine (PHA) toe aan elk putje en resuspendeert u grondig. Plaats deze platen terug in de incubator (5% CO2, 37 °C).NOTITIE: Dit is de starttijd van de test. Blokkeer de cytokinese 23 uur na stimulatie door 8 μL cytochalasine B (6 μg/ml) per putje toe te voegen en goed te resuspenderen. Oogst de celculturen 70 uur na stimulatie/kweektijd. Resuspendeer en breng de cellen over naar een buis van 15 ml. Spoel elk putje af met 2 ml PBS en voeg dit PBS toe aan de betreffende tube van 15 ml. Centrifugeer de buisjes gedurende 8 minuten bij 180 × g, bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg, maar laat ongeveer 500 μL over de pellet. Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg tijdens het vortexen langzaam druppelsgewijs 2 ml koud kaliumchloride (KCl, 4 °C) toe. Centrifugeer de cellen onmiddellijk bij 180 × g gedurende 8 minuten. Gooi de supernatant weg en laat ongeveer 500 μl van de supernatant over. Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg tijdens het vortexen langzaam druppelsgewijs 2 ml koud fixeermiddel 1 toe (methanol/azijnzuur/ringeroplossing in een verhouding van 4:1:5). Laat de monsterbuisjes een nacht bij 4 °C staan (minimaal 12 uur en maximaal 96 uur). Centrifugeer gedurende 8 minuten op 180 × g. Gooi de supernatant weg. Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg tijdens het vortexen langzaam druppelsgewijs 2 ml koud fixatief 2 toe (methanol/azijnzuur in een verhouding van 4:1). Centrifugeer gedurende 8 minuten op 180 × g. Gooi de supernatant weg. Draai de pellet (op volle snelheid) en voeg dan langzaam (druppelsgewijs), terwijl je vortexeert, 2 ml koud fixeermiddel 2 toe aan de pellet. Laat de monsterbuisjes bij 4 °C staan (minimaal 12 uur en maximaal 96 uur). Reinig de objectglaasjes met isopropanol en label ze op de juiste manier.OPMERKING: Gebruik bedrukte stickers om te labelen, aangezien markeerinkt gemakkelijk kan worden weggeveegd tijdens de verwerking. Centrifugeer de monsterbuisjes gedurende 8 minuten bij 180 × g. Breng het supernatans over in een andere buis om de cellen te concentreren op basis van de grootte van de pellet. Draai de pellet vortex. Laat 40 μL van de vaste cellen op een droog en schoon glaasje vallen. Laat de glaasjes drogen op kamertemperatuur. Bewaar de objectglaasjes in een doos of beits ze onmiddellijk ter observatie. 5. Acridine oranje (AO) kleuring Dompel de objectglaasjes 1 minuut onder in AO-kleurstof, gevolgd door een snelle wasbeurt in het gedestilleerde water en plaats de objectglaasjes vervolgens 1 minuut in fosfaatbuffer (pH 6,8). Haal de glaasjes uit de bufferoplossing en droog met schoon tissuepapier de achterkant van de glaasjes af en leg de glaasjes op een schoon tissuepapier. Laat 20 μL van de fosfaatbuffer op het objectglaasje vallen en dek het voorzichtig af met een schoon dekglaasje, vermijd luchtbellen. Sluit deze glaasjes af met siliconencement.OPMERKING: Aangezien AO lichtgevoelig is en na verloop van tijd vervaagt, wordt aanbevolen om de dia’s binnen 5 dagen na kleuring te scoren voor een mooi contrast en fluorescentie. Bewaar objectglaasjes altijd in een koelcel (4 °C) als ze niet worden onderzocht. 6. Puntendelven van bevlekte dia’s Plaats uw objectglaasje onder een fluorescentiemicroscoop en onderzoek 1.000 tweekernige cellen (BN’s). Tel handmatig MN’s, een van de zes biomarkers van toxiciteit. Om dit te doen, laat twee onafhankelijke scorers 500 BN-cellen/glaasje onderzoeken onder dezelfde vergroting.OPMERKING: Hieronder volgen enkele hoogtepunten van de scoringscriteria, zoals aanbevolen door Fenech om de gekleurde objectglaasjes te scoren9Selecteer een BN-cel door te zoeken naar mooi afgeronde cellen met intact cytoplasma, met twee goed onderscheiden kernen van ongeveer dezelfde grootte, regelmatige vorm en kleurpatroon. Zorg ervoor dat het cytoplasma van de BN-cel te onderscheiden is van het cytoplasma van de aangrenzende cel. Scoor een MN en merk op dat het morfologisch identiek is aan, maar kleiner is dan de hoofdkernen; zelfs de grootste MN kan niet meer zijn dan 1/3 van de diameter van de hoofdkernen. Scoor een MN alleen als het de hoofdkernen niet raakt of als ten minste de micronucleaire grens te onderscheiden is van de grens van de hoofdkernen.