Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus
Summary
Desenvolvemos vários protocolos para induzir dano ou degeneração retiniana em girinos de Xenopus laevis . Esses modelos oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de regeneração retiniana.
Abstract
As doenças neurodegenerativas da retina são as principais causas de cegueira. Dentre as inúmeras estratégias terapêuticas exploradas, o estímulo à auto-reparação emergiu recentemente como particularmente atraente. Uma fonte celular de interesse para o reparo da retina é a célula glial de Müller, que abriga potencial de células-tronco e extraordinária capacidade regenerativa em anamniotas. Este potencial é, no entanto, muito limitado em mamíferos. O estudo dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração retiniana em modelos animais com capacidades regenerativas deve fornecer informações sobre como desbloquear a capacidade latente das células de Müller de mamíferos de regenerar a retina. Este é um passo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na medicina regenerativa. Para isso, desenvolvemos vários paradigmas de lesão retiniana em Xenopus: uma lesão retiniana mecânica, uma linha transgênica que permite a ablação condicional de fotorreceptores mediada por nitroredutase, um modelo de retinose pigmentar baseado em knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 e um modelo citotóxico conduzido por injeções intraoculares de CoCl2 . Destacando suas vantagens e desvantagens, descrevemos aqui esta série de protocolos que geram várias condições degenerativas e permitem o estudo da regeneração retiniana em Xenopus.
Introduction
Milhões de pessoas em todo o mundo são acometidas por várias doenças degenerativas da retina que levam à cegueira, como retinose pigmentar, retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Até o momento, essas condições permanecem em grande parte intratáveis. As abordagens terapêuticas atuais em avaliação incluem terapia gênica, transplantes de células ou tecidos, tratamentos neuroprotetores, optogenética e dispositivos protéticos. Outra estratégia emergente baseia-se na autorregeneração por meio da ativação de células endógenas com potencial de células-tronco. As células gliais de Müller, o principal tipo de célula glial da retina, estão entre as fontes celulares de interesse nesse contexto. Ao serem lesados, podem se desdiferenciar, proliferar e gerar neurônios 1,2,3. Embora este processo seja muito eficaz em peixes-zebra ou Xenopus, é em grande parte ineficiente em mamíferos.
No entanto, tem sido demonstrado que tratamentos adequados com proteínas mitogênicas ou superexpressão de vários fatores podem induzir a reentrada no ciclo celular da glia de Müller de mamíferos e, em alguns casos, desencadear seu subsequente comprometimento neurogênico 1,2,3,4,5. Isso permanece, no entanto, em grande parte insuficiente para os tratamentos. Assim, aumentar nosso conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração é necessário para identificar moléculas capazes de transformar eficientemente as propriedades das células-tronco de Müller em novas estratégias terapêuticas celulares.
Com esse objetivo, desenvolvemos vários paradigmas de lesão em Xenopus que desencadeiam a degeneração das células da retina. Aqui, apresentamos (1) uma lesão mecânica retiniana que não é específica do tipo celular, (2) um modelo de ablação celular condicional e reversível usando o sistema NTR-MTZ que tem como alvo as células bastonetes, (3) um knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, um modelo de retinose pigmentar que desencadeia degeneração progressiva de células bastonetes e ( 4) uma CoCl2-modelo citotóxico induzido que, de acordo com a dose, pode visar especificamente os cones ou levar a uma degeneração celular mais ampla da retina. Destacamos as particularidades, vantagens e desvantagens de cada paradigma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantagens e desvantagens de vários paradigmas de lesão retiniana em girinos Xenopus
Lesão mecânica da retina
Várias lesões cirúrgicas da retina neural foram desenvolvidas em girinos de Xenopus. A retina neural pode ser totalmente removida 15,16 ou apenas parcialmente excisada 16,17. A lesão mecânica aqui apresentad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de M.P. da Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) em parceria com ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
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