توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus
Summary
لقد قمنا بتطوير العديد من البروتوكولات للحث على تلف الشبكية أو تنكس الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis . توفر هذه النماذج إمكانية دراسة آليات تجديد الشبكية.
Abstract
الأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين هي الأسباب الرئيسية للعمى. من بين العديد من الاستراتيجيات العلاجية التي يتم استكشافها ، ظهر تحفيز الإصلاح الذاتي مؤخرا على أنه جذاب بشكل خاص. المصدر الخلوي المهم لإصلاح الشبكية هو خلية مولر الدبقية ، التي تؤوي إمكانات الخلايا الجذعية وقدرة تجددية غير عادية في anamniotes. ومع ذلك ، فإن هذه الإمكانات محدودة للغاية في الثدييات. يجب أن توفر دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الشبكية في النماذج الحيوانية ذات القدرات التجديدية نظرة ثاقبة حول كيفية إطلاق العنان للقدرة الكامنة لخلايا مولر الثديية على تجديد شبكية العين. هذه خطوة أساسية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية في الطب التجديدي. لتحقيق هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج إصابة الشبكية في Xenopus: إصابة ميكانيكية في الشبكية ، وخط معدل وراثيا يسمح بالاستئصال الشرطي لمستقبلات الضوء بوساطة النيتروريدوكتاز ، ونموذج التهاب الشبكية الصباغي القائم على خروج المغلوب رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، ونموذج سام للخلايا مدفوع بحقن CoCl2 داخل العين. تسليط الضوء على مزاياها وعيوبها ، وصفنا هنا هذه السلسلة من البروتوكولات التي تولد حالات تنكسية مختلفة وتسمح بدراسة تجديد الشبكية في Xenopus.
Introduction
يعاني ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم من أمراض تنكسية مختلفة في شبكية العين تؤدي إلى العمى ، مثل التهاب الشبكية الصباغي أو اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). حتى الآن ، لا تزال هذه الحالات غير قابلة للعلاج إلى حد كبير. تشمل الأساليب العلاجية الحالية قيد التقييم العلاج الجيني ، وزرع الخلايا أو الأنسجة ، والعلاجات الوقائية العصبية ، وعلم البصريات الوراثي ، والأجهزة التعويضية. وتستند استراتيجية ناشئة أخرى إلى التجديد الذاتي من خلال تنشيط الخلايا الداخلية ذات إمكانات الخلايا الجذعية. خلايا مولر الدبقية ، نوع الخلايا الدبقية الرئيسي في شبكية العين ، هي من بين المصادر الخلوية ذات الأهمية في هذا السياق. عند الإصابة ، يمكنهم إلغاء التمايز والتكاثر وتوليد الخلايا العصبية1،2،3. على الرغم من أن هذه العملية فعالة جدا في الزرد أو Xenopus ، إلا أنها غير فعالة إلى حد كبير في الثدييات.
ومع ذلك ، فقد ثبت أن العلاجات المناسبة بالبروتينات الانقسامية أو الإفراط في التعبير عن عوامل مختلفة يمكن أن تحفز عودة دورة الخلايا الدبقية في الثدييات مولر ، وفي بعض الحالات ، تؤدي إلى التزامها اللاحق بتكوين الخلايا العصبية1،2،3،4،5. ومع ذلك ، لا يزال هذا غير كاف إلى حد كبير للعلاجات. ومن ثم ، فإن زيادة معرفتنا بالآليات الجزيئية الكامنة وراء التجديد أمر ضروري لتحديد الجزيئات القادرة على تحويل خصائص الخلايا الجذعية مولر بكفاءة إلى استراتيجيات علاجية خلوية جديدة.
مع هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج الإصابة في Xenopus التي تؤدي إلى تنكس خلايا الشبكية. هنا ، نقدم (1) إصابة ميكانيكية في شبكية العين ليست خاصة بنوع الخلية ، (2) نموذج استئصال الخلايا المشروط والقابل للانعكاس باستخدام نظام NTR-MTZ الذي يستهدف الخلايا القضيبية ، (3) ضربة قاضية رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، نموذج التهاب الشبكية الصباغي الذي يؤدي إلى تنكس خلايا القضيب التدريجي ، و (4) CoCl2– نموذج سام للخلايا مستحث يمكن أن يستهدف المخاريط على وجه التحديد أو يؤدي إلى تنكس خلايا الشبكية على نطاق أوسع. نسلط الضوء على خصوصيات ومزايا وعيوب كل نموذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا وعيوب نماذج إصابة الشبكية المختلفة في الضفادع الصغيرة Xenopus
إصابة الشبكية الميكانيكية
تم تطوير إصابات جراحية مختلفة في شبكية العين العصبية في الضفادع الصغيرة Xenopus. قد تتم إزالة الشبكية العصبية بالكامل 15,16 أو استئصالها جزئيافقط 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال منح إلى M.P. من جمعية شبكية العين في فرنسا ، ومؤسسة فرنسا ، ونشرة الهجرة القسرية (مؤسسة الأمراض الراديوية) ، و BBS (جمعية متلازمة بارديه بيدل) ، و UNADEV (الاتحاد الوطني للعلماء و Déficients Visuels) بالشراكة مع ITMO NNP (المعهد المسرحي متعدد الكائنات الحية ، العلوم المعرفية ، علم الأعصاب ، الطب النفسي) / AVIESAN (التحالف الوطني لعلوم الحياة والصحة).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
