יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס
Summary
פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.
Abstract
מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית הן הגורמים המובילים לעיוורון. בין אסטרטגיות טיפוליות רבות הנחקרות, גירוי תיקון עצמי התגלה לאחרונה כמושך במיוחד. מקור עניין תאי לתיקון רשתית הוא תא הגליה מולר, הטומן בחובו פוטנציאל תאי גזע ויכולת התחדשות יוצאת דופן באנמניוטים. עם זאת, פוטנציאל זה מוגבל מאוד ביונקים. חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הרשתית במודלים של בעלי חיים בעלי יכולות התחדשות אמור לספק תובנות כיצד לפתוח את היכולת הסמויה של תאי מולר של יונקים לחדש את הרשתית. זהו צעד מפתח לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית. לשם כך פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס: פגיעה מכנית ברשתית, קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז, מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ומודל ציטוטוקסי המונע על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות. הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם, אנו מתארים כאן סדרה זו של פרוטוקולים היוצרים מצבים ניווניים שונים ומאפשרים את המחקר של התחדשות הרשתית ב Xenopus.
Introduction
מיליוני אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלות ניווניות שונות ברשתית המובילות לעיוורון, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). נכון להיום, מצבים אלה נותרו במידה רבה בלתי ניתנים לטיפול. הגישות הטיפוליות הנוכחיות הנמצאות בהערכה כוללות ריפוי גנטי, השתלות תאים או רקמות, טיפולים נוירופרוטקטיים, אופטוגנטיקה והתקנים תותבים. אסטרטגיה מתפתחת נוספת מבוססת על התחדשות עצמית באמצעות הפעלת תאים אנדוגניים בעלי פוטנציאל תאי גזע. תאי גליה מסוג מולר, סוג תאי הגליה העיקריים ברשתית, הם בין המקורות התאיים המעניינים בהקשר זה. לאחר פציעה, הם יכולים להתמיין, להתרבות, וליצור נוירונים 1,2,3. למרות שתהליך זה יעיל מאוד בדגי זברה או בקסנופוס, הוא אינו יעיל במידה רבה ביונקים.
עם זאת, הוכח כי טיפולים מתאימים עם חלבונים מיטוגניים או ביטוי יתר של גורמים שונים יכולים לגרום לכניסה מחודשת של מחזור תאי גליה של יונקים, ובמקרים מסוימים, לעורראת מחויבותם לנוירוגנזה 1,2,3,4,5. עם זאת, זה עדיין לא מספיק במידה רבה לטיפולים. לפיכך, הרחבת הידע שלנו על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתחדשות נחוצה כדי לזהות מולקולות המסוגלות להפוך ביעילות תכונות תאים דמויי גזע של מולר לאסטרטגיות טיפוליות תאיות חדשות.
במטרה זו, פיתחנו מספר פרדיגמות פציעה ב – Xenopus המעוררות ניוון תאי רשתית. כאן, אנו מציגים (1) פגיעה רשתית מכנית שאינה ספציפית לסוג התא, (2) מודל אבלציה מותנה והפיך של תאים באמצעות מערכת NTR-MTZ המכוונת לתאי מוט, (3) נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה המעורר ניוון מתקדם של תאי מוט, ו-(4) CoCl2-מודל ציטוטוקסי המושרה שעל פי המינון יכול להתמקד ספציפית בקונוסים או להוביל לניוון רחב יותר של תאי הרשתית. אנו מדגישים את הייחודיות, היתרונות והחסרונות של כל פרדיגמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
יתרונות וחסרונות של פרדיגמות שונות של פגיעה ברשתית בראשנים של קסנופוס
פגיעה מכנית ברשתית
פציעות כירורגיות שונות של הרשתית העצבית פותחו בראשנים של קסנופוס. הרשתית העצבית יכולה להיות מוסרת לחלוטין15,16 או נכרתה רק חלקית <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל- M.P. מהאגודה Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ו- UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) בשיתוף עם ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
