Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成
Summary
私たちは、 Xenopus laevis オタマジャクシの網膜損傷または網膜変性を誘発するためのいくつかのプロトコルを開発しました。これらのモデルは、網膜再生メカニズムを研究する可能性を提供します。
Abstract
網膜神経変性疾患は失明の主な原因です。数多くの治療戦略が検討されている中で、最近、刺激的な自己修復が特に魅力的に浮上しています。網膜修復に関心のある細胞源はミュラーグリア細胞であり、幹細胞の可能性とアナムニオテスの並外れた再生能力を秘めています。しかし、この可能性は哺乳類では非常に限られています。再生能力を持つ動物モデルで網膜再生の根底にある分子メカニズムを研究することで、哺乳類ミュラー細胞の網膜再生能力を解き放つ方法についての洞察が得られるはずです。これは、再生医療における治療戦略の開発にとって重要なステップです。この目的のために、Xenopusでは、機械的網膜損傷、ニトロレダクターゼを介した光受容体条件付きアブレーションを可能にするトランスジェニックライン、CRISPR/Cas9を介したロドプシンノックアウトに基づく網膜色素変性症モデル、および眼内CoCl2注射によって駆動される細胞傷害モデルなど、いくつかの網膜損傷パラダイムを開発しました。それらの長所と短所を強調して、ここでは、さまざまな変性状態を生成し、Xenopusにおける網膜再生の研究を可能にするこの一連のプロトコルについて説明します。
Introduction
世界中の何百万人もの人々が、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)など、失明につながるさまざまな網膜変性疾患に苦しんでいます。今日まで、これらの状態はほとんど治療できないままです。現在評価されている治療法には、遺伝子治療、細胞または組織移植、神経保護治療、光遺伝学、補綴装置などがあります。もう一つの新たな戦略は、幹細胞の潜在能力を持つ内因性細胞の活性化による自己再生に基づいています。網膜の主要なグリア細胞型であるミュラーグリア細胞は、この文脈で関心のある細胞源の一つです。損傷を受けると、それらは脱分化、増殖、およびニューロンを生成することができます1,2,3。このプロセスはゼブラフィッシュやゼノプスでは非常に効果的ですが、哺乳類ではほとんど非効率的です。
それにもかかわらず、分裂促進タンパク質またはさまざまな要因の過剰発現による適切な処理は、哺乳類ミュラーグリア細胞周期の再突入を誘発し、場合によっては、その後の神経新生コミットメントを引き起こす可能性があることが示されています1,2,3,4,5。しかし、これは治療にはほとんど不十分なままです。したがって、再生の根底にある分子メカニズムに関する知識を深めることは、ミュラー幹様細胞の特性を新しい細胞治療戦略に効率的に変換できる分子を特定するために必要です。
この目的のために、私たちは網膜細胞の変性を引き起こすいくつかの傷害パラダイムを Xenopus で開発しました。ここでは、(1)細胞型に特異的ではない機械的網膜損傷、(2)桿体細胞を標的とするNTR-MTZシステムを用いた条件付きおよび可逆的細胞アブレーションモデル、(3)CRISPR/Cas9を介した ロドプシン ノックアウト、進行性桿体細胞変性を引き起こす網膜色素変性症のモデル、 および(4)CoCl2-用量に応じて、錐体を特異的に標的にしたり、より広範な網膜細胞変性を引き起こしたりできる誘導細胞傷害性モデル。各パラダイムの特殊性、長所、短所を強調します。
Protocol
動物の飼育と実験は、施設のライセンスA91272108の下で、施設のガイドラインに従って行われました。研究プロトコルは、施設動物管理委員会CEEA #59によって承認され、参照番号APAFIS #32589-2021072719047904 v4およびAPAFIS #21474-2019071210549691 v2の下でDirection Départementale de la Protection des Populationsによって承認されました。これらのプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細?…
Representative Results
機械的網膜損傷プロトコルセクション1に記載されている機械的損傷を受けたオタマジャクシの網膜切片は、網膜病変が穿刺部位に限定されたまま、組織のすべての層を包含していることを示しています(図2A、B)。 NTR-MTZシステムを用いた条件付き桿体細胞アブレーションプロトコルセクション2に記載され?…
Discussion
Xenopusオタマジャクシにおけるさまざまな網膜損傷パラダイムの長所と短所
機械的網膜損傷
Xenopusオタマジャクシでは、神経網膜のさまざまな外科的損傷が開発されています。神経網膜は、完全に切除されるか15,16か、部分的にのみ切除されるかのどちらかである16,17。<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、ITMO NNP(Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie)/ AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé)と共同で、Association Retina France、Fondation de France、FMR(Fondation Maladies Rares)、BBS(Association du syndrome de Bardet-Biedl)、UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels)の助成金を受けて行われました。
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
References
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Cite This Article
Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).