В этой работе представлен альтернативный препарат плоской сетчатки, в котором удаление тел фоторецепторных клеток обеспечивает более быструю диффузию антител и улучшенный доступ к внутренним нейронам сетчатки с помощью пипетки для иммуногистохимии, гибридизации in situ и электрофизиологических экспериментов.
Биполярные клетки и горизонтальные клетки сетчатки позвоночных являются первыми нейронами, которые обрабатывают визуальную информацию после того, как фотоны детектируются фоторецепторами. Они выполняют фундаментальные операции, такие как адаптация света, контрастная чувствительность, пространственная и цветовая оппоненция. Полное понимание точных схем и биохимических механизмов, которые управляют их поведением, будет способствовать развитию исследований в области визуальной нейробиологии и офтальмологической медицины. Тем не менее, современные препараты для исследования биполярных и горизонтальных клеток (целые срезы сетчатки и вертикальные срезы) ограничены в своей способности охватить анатомию и физиологию этих клеток. В данной работе мы представляем метод удаления телец фоторецепторных клеток из сетчатки живых плоских мышей, обеспечивающий расширенный доступ к биполярным и горизонтальным клеткам для эффективного пережатия пластырей и быстрого иммуномечения. Расщепленная сетчатка готовится путем зажатия изолированной сетчатки мыши между двумя кусочками нитроцеллюлозы, а затем осторожно отделяя их друг от друга. При разделении сетчатка расщепляется чуть выше внешнего плексиформного слоя с образованием двух кусочков нитроцеллюлозы, один из которых содержит тела фоторецепторных клеток, а другой — оставшуюся внутреннюю часть сетчатки. В отличие от вертикальных срезов сетчатки, препарат расщепленной сетчатки не разрывает дендритные отростки внутренних нейронов сетчатки, что позволяет регистрировать биполярные и горизонтальные клетки, которые интегрируют вклад сетей, связанных с щелевыми контактами, и широкопольных амакриновых клеток. Данная работа демонстрирует универсальность данного препарата для исследования горизонтальных и биполярных клеток в электрофизиологии, иммуногистохимии и экспериментах по гибридизации in situ .
Сетчатка представляет собой тонкую нервную ткань, расположенную в задней части глаза, где свет перехватывается и преобразуется в электрохимический сигнал, который может быть интерпретирован мозгом. В задней части сетчатки фоторецепторы палочек и колбочек стимулируются светом, что снижает скорость тонического высвобождения нейромедиатора глутамата1. Первыми нейронами, которые испытывают и реагируют на это вызванное светом изменение концентрации глутамата, являются биполярные клетки (BC) и горизонтальные клетки (HC), чьи сомы находятся во внешней области внутреннего ядерного слоя (INL). Эти нейроны второго порядка выполняют первую стадию обработки сигналов в сетчатке и формируют важнейшие характеристики зрения, такие как адаптация к свету, контрастная чувствительность и пространственная/цветоваяпротивоположность. Несмотря на то, что эти функции приписываются БК и ГЦ, схемотехника и биохимические механизмы, лежащие в основе этих процессов, доконца не изучены. Поэтому развитие средств и методов изучения физиологии БК и ГК имеет первостепенное значение.
Вертикальные (поперечные) срезы сетчатки давно зарекомендовали себя как наиболее практичная модель для изучения БК и ГК; однако некоторые аспекты физиологии БК и ГЦ недоступны экспериментатору в рамках этой модели. Прямые записи от ГЦ или косвенные измерения их влияния на БК не отражают эндогенную связность сетчатки, поскольку латеральные отростки этих клеток разрываются во время среза. Цельные препараты сетчатки позволяют обойти эту проблему, сохраняя эти боковые отростки, но окружающие слои сетчатки создают проблему для доступа кэтим клеткам. Несмотря на то, что существует множество примеров иммуноокрашивания 5,6,7,8 и записи патч-клэмпов9 из нейронов INL в сетчатке всего маунта, существует возможность ускорить и упростить сбор этих данных. Ограничения, присущие поперечным сечениям, и проблемы, связанные со всей моделью монтировки, вдохновили на разработку этого альтернативного плоского препарирования сетчатки.
В следующей работе описывается протокол для легкого удаления фоторецепторного слоя с живой, плоской сетчатки для улучшения доступа к РМЖ и ГЦ для упрощения зажима пластырей и более быстрого и эффективного иммуномечения. Отслаивание двух кусков нитроцеллюлозной мембраны, прикрепленных к обеим сторонам изолированной сетчатки, разрывает ткань через аксоны фоторецепторов, оставляя расщепленную сетчатку, которая сохраняет внешний плексиформный слой (OPL) и все внутренние слои сетчатки. В то время как другие описывают протоколы механического разделения слоев сетчатки, эти методы либо плохо подходят для наложения заплаток и микроскопии, либо требуют утомительных манипуляций с тканями. Некоторые из этих методов требуют замороженной или лиофилизированной ткани для разделения слоев, что делает их несовместимыми с электрофизиологическими экспериментами10,11,12. Другие предназначены для живых тканей, но требуют 5-15 последовательных пилингов фильтровальной бумагой 4,11 или обработки трипсином 13 для удаления фоторецепторов. Описанный здесь метод является улучшением по сравнению со своими предшественниками, упрощая процедуру удаления фоторецепторов и расширяя репертуар последующих применений.
После того, как фоторецепторы преобразуют поглощение фотонов в высвобождение нейротрансмиттеров, BC и HC являются первыми нейронами сетчатки, которые обрабатывают визуальный сигнал23. Несмотря на то, что важность этих нейронов хорошо известна, многие из их функций не до конца изучены или вообще не изучены. Во многих исследованиях физиологии РМЖ и ГК, вероятно, будет полезно использовать плоский препарат сетчатки, который улучшает доступ к нейронам INL, сохраняя при этом латеральную связь. Разработка метода расщепления сетчатки представляет собой попытку обеспечить простой протокол для получения высококачественных электрофизиологических записей и данных микроскопии от БК и ГК в плоской ориентации. Описанная здесь подготовка расщепленной сетчатки может быть выполнена примерно за 20 минут на мышь (10 минут на сетчатку) после изоляции сетчатки, без использования специализированного оборудования. Метод основан на существующих процедурах удаления фоторецепторов, но предлагает значительные улучшения в простоте, скорости и универсальности 4,10,11,12,13. В отличие от предыдущих методов разделения слоев сетчатки, расщепление сетчатки не требует замораживания, лиофилизации или многократного нанесения клея на сетчатку. С практикой почти все фоторецепторы могут быть удалены за один разрыв с помощью нитроцеллюлозной мембраны. Скорость и простота этого подхода позволяет свести к минимуму время, которое сетчатка проводит вне карбогенированного Эймса, обеспечивая высокую жизнеспособность клеток в течение длительных периодов времени; Расщепленная сетчатка может сохраняться в карбонизированной среде Эймса в течение нескольких часов после расщепления. В качестве свидетельства здоровья нейронов INL в этом препарате, окрашивание живых/мертвых клеток (рис. 4) и электрофизиология с заплатками (рис. 6) подтверждают жизнеспособность эритроцитов и ГЦ после расщепления.
Удаление фоторецепторного слоя в расщепленной сетчатке дает значительное преимущество при иммуномечении, резко сокращая время диффузии антител в INL. Маркировка первичными и вторичными антителами может быть завершена в течение 2 ч, что является существенным улучшением по сравнению с обычным плоским окрашиванием, которое может занять 72 часа или дольше в зависимости от целевого показателя 5,6,7,8,20,22. В результате данные микроскопии могут быть получены в тот же день, что и подготовка тканей, что значительно ускоряет темпы иммунофлуоресцентных экспериментов. Для облегчения отжига зондов мРНК эксперименты FISH обычно рекомендуют гораздо более длительное время фиксации (~24 ч), чем иммуномечение18. Тем не менее, эксперименты, представленные здесь, показывают, что фиксация в течение 2 ч по-прежнему дает исключительную маркировку FISH (рис. 5). Несмотря на увеличение времени фиксации с 30 мин до 2 ч, не было необходимости выполнять шаги по извлечению антигена для получения отличной иммунометки, но это может варьироваться в зависимости от антитела или антигена. Лечение протеазой в протоколе FISH может влиять на мечение антител, вероятно, из-за разрушения эпитопов-мишеней. Эту проблему удалось обойти с помощью поликлональных антител, нацеленных на несколько эпитопов, что снизило вероятность того, что разрушение эпитопов будет препятствовать иммуномечению. Кроме того, была использована умеренная терапия протеазой (ACD protease III) для предотвращения чрезмерного изменения эпитопов, обеспечивая при этом достаточное проникновение в ткани.
Иногда сетчатка вместо этого расщепляется через внешний ядерный слой (ONL), оставляя после себя слои фоторецепторных сом, в которых не видно INL-клеток. Чтобы предотвратить это, следует убедиться, что сетчатка полностью лежит на стекле, и что все остатки жидкости вокруг сетчатки удалены. Более сильное надавливание на нитроцеллюлозу кистью также может помочь предотвратить расщепление через ONL. Если мембрана становится слишком влажной или сетчатка складывается сама по себе, шансы на успешное расщепление значительно уменьшаются. Использование DAPI для окрашивания клеточных ядер полезно для оценки качества расщепления и для определения покрытия оставшихся фоторецепторов. Ядра фоторецепторов меньше, ярче и более поверхностны (дополнительный рисунок 3A), в то время как ядра BC крупнее, тусклее и глубже (дополнительный рисунок 3B). В некоторых случаях плоскость разрыва будет незначительно отличаться по части сетчатки, что приведет к образованию участков, в которых тела фоторецепторов клеток не были полностью удалены (дополнительный рисунок 3C). Для применения в микроскопии и электрофизиологии это не мешает сбору качественных данных из областей, где фоторецепторы были должным образом удалены; Большие открытые поля внутренней части сетчатки можно легко обнаружить при визуализации или записи с помощью пластырной пипетки. Если требуется более полное удаление фоторецепторов, второй разрыв может быть выполнен с помощью дополнительного куска нитроцеллюлозной мембраны, хотя 100% удаление фоторецепторов не гарантируется. Поэтому рекомендуется соблюдать осторожность при использовании расщепленной сетчатки в исследованиях экспрессии генов или протеомики, где остаточный фоторецепторный материал может повлиять на результаты. Для применения с одиночными клетками это беспокойство необоснованно, так как данные от фоторецепторов могут быть исключены из анализа.
Преимущества препарирования расщепленной сетчатки, пожалуй, наиболее заметны при электрофизиологических записях широкопольных интернейронов. В то время как традиционные вертикальные срезы прерывают обширные процессы широкопольных клеток, расщепление сетчатки оставляет OPL и IPL нетронутыми, позволяя захватывать входные данные от широкопольных клеток, таких как HCs 24, A17s25, TH ACs 26 и NOS-1 ACs27, которые в противном случае были бы упущены из виду на вертикальных срезах. Поэтому интерпретация результатов и сравнение с предыдущими данными, собранными на срезах сетчатки, требует тщательного обдумывания. Тем не менее, в экспериментах с использованием фармакологических имитаторов световой стимуляции эти результаты напоминают данные, полученные насрезах сетчатки. Экспрессируя ChR2 под клеточно-специфическими промоторами, можно стимулировать желаемую клеточную популяцию во время записи из БК в INL для изучения влияния желаемой клетки на вертикальный информационный путь. Запись непосредственно с более глубоких нейронов INL, таких как амакриновые клетки, также возможна в расщепленной сетчатке. Несмотря на то, что в этом случае пластырный электрод должен сначала пройти через более поверхностные нейроны INL, по сравнению с традиционным целым монтажным препарированием его путь преграждает значительно меньше тканей.
В дополнение к измерению влияния широкопольных клеток на другие нейроны, этот метод позволяет напрямую зажимать одноклеточные патчи от HC, дендриты которых образуют обширную щелевую связанную сеть в OPL28. Горизонтальные клетки посылают критическую обратную связь фоторецепторам, которые формируют передачу вертикальной информации через сетчатку. Однако, поскольку дендритные поля HC усечены в вертикальных срезах, данные регистрации отдельных клеток отсутствуют. В данной работе представлены анатомически и физиологически интактные ГЦ, от которых токи, вызванные ChR2, регистрируются в тройной трансгенной линии мышей (рис. 6 C-E). Вне стимуляции ChR2 расщепленная сетчатка может быть использована для изучения эндогенных токов HC и щелевой связи28. В то время как расщепленная сетчатка представляет собой удобную модель для изучения синаптических связей и активности нейронов, индуцированных химическим применением или стимуляцией ChR2, отсутствие фоторецепторов исключает любое прямое исследование естественных световых реакций или механизмов адаптации света.
Визуализация in situ на сетчатке в последние годы достигла замечательного прогресса. Тем не менее, большинство визуализирующих исследований ограничиваются слоем ганглиозных клеток в препаратах сетчатки29. Авторы предполагают, что отсутствие фоторецепторов в расщепленной сетчатке сделает ее идеальной моделью для визуализации кальция в реальном времени в OPL и INL. Помимо визуализации кальция, эта модель имеет большой потенциал для использования с генетически кодируемыми биосенсорами, такими как iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 и pHluorin33. В сочетании с препарированием расщепленной сетчатки эти мощные инструменты могут предложить эффективный подход к изучению синаптических взаимодействий и биофизических свойств БК и НС, которые способствуют обработке света в сетчатке.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана следующими грантами NIH: грант NIH R01EY031596 (C.M.); Грант NIH R01EY029985 (C.M.); Грант NIH P30EY010572 (C.M.); Грант NIH R01EY032564 (B.S.). Мы благодарим Тэмми Хейли за техническую поддержку в подготовке срезов сетчатки и д-ра Чарльза Аллена за щедрый вклад в зонды мРНК FISH, использованные в этой работе.
#1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |