脊椎動物の網膜の内核層ニューロンを研究するための改良されたフラットマウント調製としてのスプリット網膜

マウスに水と餌を自由に与え、12時間の明暗サイクルで維持しました。マウスは、イソフルランへの曝露とそれに続く子宮頸部脱臼によって安楽死させられました。すべての動物処置は、米国国立衛生研究所のガイドラインに従っており、オレゴン健康科学大学の動物実験委員会によって承認されました。 注:眼球摘出術、網膜解剖、網膜分割は、生体組織の健康を維持するためにできるだけ早く行う必要があります。片目4分3ヶ月)の雌雄のC57BL/6Jマウスを実験に用いた。シナプス形態については、Pcp2プロモーター(Pcp2-cre/GFP)14 で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するマウスを用いた。トランスジェニックマウス:免疫組織化学または電気生理学実験中のGFPによる水平細胞の可視化には、トリプルトランスジェニックマウスvGATFLPoを使用しました。vGlut2Cre;Ai80dです。vGATFlpo株およびvGluT2Cre株は、それぞれのプロモーターの下流にFlpoまたはCreリコンビナーゼを発現するノックインマウスです。Ai80dマウスは交差レポーターマウス(CatCh/EYFP)であり、CreおよびFlpoリコンビナーゼを発現する細胞においてのみCa2+ 透過性チャネルロドプシン(ChR2)を発現します。したがって、トリプルトランスジェニックマウスは、VGATとvGluT2の両方の発現歴を持つ細胞でのみChR2を発現します。 1.網膜解離および網膜裂片のための材料調製 ニトロセルロースメンブレンのピースを準備します注:分割網膜をニトロセルロースメンブレンから剥離すると、顕微鏡でのバックグラウンド蛍光が減少し、パッチクランプによる記録が簡素化されます。膜除去は、組織固定の前または後に行うことができます。固定された分割網膜の場合、ニトロセルロース膜の断片を処理する必要はありません。生きている裂けた網膜の場合、組織からの穏やかな剥離を容易にするために、ステップ1.1.3〜1.1.5に従って膜を処理します。16個(またはそれ以上)のニトロセルロースメンブレンを5mm x 5mmの正方形にカットします。余分なものはまとめて準備し、将来の使用のために保管することができます。 後で使用するために、メンブレンの半分を取っておきます。これらの破片はブロッキング溶液で処理されません。 残りの断片を界面活性剤を含まないIHCブロッキング溶液(PBSで希釈した3%ウマ血清+0.025%NaN3 など)で室温で10分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。注意: NaN3 は強力な毒素であるため、取り扱いには適切な PPE を使用してください。 メンブレン片を、重炭酸緩衝エーム培地中で室温で10分間、穏やかに振とうしてインキュベートすることにより、完全に洗浄します。 閉塞したメンブレン片を完全に風乾します(~20分)。メンブレン片にラベルを貼り、室温で保管し、未処理のメンブレン片から分離してください。 エイムズ培地の準備重炭酸緩衝エーム培地を調製し、一定のカルボゲン化(95%O2および5%CO2)下で溶液を室温に維持します。 2.マウス眼球摘出術 機関のIACUCガイドラインに従って、利用可能な方法でマウスを安楽死させます。 マウスを片側にひっくり返し、2本の指で眼窩の周りをそっと押し下げます。これにより、目が頭蓋骨から膨らみます。 湾曲した解剖ハサミを使用して、膨らんだ目の下を切り取り、視神経を切断し、目を頭蓋骨から分離します。 ハサミで目をすくい、氷冷したエイムズ培地で満たされたペトリ皿に入れます。注:分裂後に組織を固定するダウンストリームアプリケーションでは、Ames培地の代わりに氷冷PBSを使用できます。 残りの目について、手順2.1〜2.4を繰り返します。 3.網膜解剖 カスタムガラストランスファーピペットを使用して、片方の目を新鮮で氷冷したエイム培地が入った新しいペトリ皿に移します。注:カスタムトランスファーピペットの開口部が広いため、組織の偶発的な押しつぶしを防ぎ、ガラスを使用することでピペットの壁への組織の付着を最小限に抑えます。ただし、広口プラスチックトランスファーピペットは、実験者がすでにこのツールの使用に習熟している場合にも許容されます。 鉗子を使用して、余分な結合組織をペトリ皿の底に固定することにより、目を安定させます。次に、25Gの針を使用して オラセラータ ラインに沿って目を穿刺し、バンナハサミのエントリーポイントを作成します。 バンナハサミを使用して、角膜が目の残りの部分から解放されるまで、オラセラータラインに沿ってカットします(補足図1A)。鉗子を使用してアイカップからレンズを取り外します(補足図1B)。 カスタムガラスピペットを使用して、アイカップを大容量(≥100 mL)のカーボゲン化エイムに移し、残りの目で手順3.1〜3.3を繰り返します。注:アイカップは、解剖がもう一方の眼で行われる間、組織の健康を維持するためにカルボゲン化されたエイムに入れられます。 1つのアイカップを、新たにカルボゲン化したエイムで満たされたペトリ皿に移します。 バンナハサミを使用して、強膜の端から内側に小さな切り込みを入れ、次に2対の鉗子を使用して強膜を網膜から剥がします(補足図1C)。鉗子で網膜をつかまないでください。代わりに、はさみ切り取りによって作成された強膜のフラップを引き離します。 バンナハサミを使用して強膜と網膜をつなぐ視神経を切り取り(補足図1D)、ハサミまたは鉗子を使用して網膜を強膜からそっとこじ開けて網膜を分離します。(図1A)。注意: RPEは通常、アイカップに取り付けられたままになりますが、網膜に取り付けられている場合、RPEを取り外すために追加の手順は必要ありません。この時点で、網膜の縁は、平坦化工程中のカールを防ぐためにメスで任意にトリミングされてもよい(図1B)。 メスを使用して網膜を半分または4分の1に切断し(図1C)、カスタムトランスファーピペットを使用して、断片を大容量(≥100 mL)の連続カーボゲン化Ames培地に戻します。注:半分または四分の一の選択は主観的です。目的のアプリケーションに最適なオプションを選択してください。 網膜の分割に進む前に、残りの目に対して手順3.5〜3.8を繰り返します。 4.網膜の分裂 ペトリ皿からエイムズ培地を廃棄し、新たにカルボゲン化したエイムと交換します。注:網膜分裂手順の残りの期間にわたってカルボゲン化を維持するには、ペトリ皿内の培地を約5分ごとに新たにカルボゲン化したエイムと交換します。 カスタムトランスファーピペットを使用して、神経節細胞側を上にしてスライドガラス(7.5 cm x 5 cm)に網膜片を置き、デリケートなタスクワイプで周囲の液体を取り除き、平らにします(図1D)。必要に応じて、解剖顕微鏡の下で細い先端の絵筆で網膜の端をそっと引っ張ります。 鉗子を使用して、乾燥した5 mm x 5 mmのニトロセルロース膜を網膜に下げ、神経節細胞側に接着させます(図1E)。注:生きた組織からの膜除去が必要な場合(つまり、電気生理学の場合)、このステップには血清処理された膜の乾燥片を使用します(詳細については、手順1.1.3〜1.1.5を参照してください)。これにより、神経節細胞層への接着強度が低下し、分裂後のニトロセルロースから網膜を除去しやすくなります。 ニトロセルロースがスライドガラスの上に載るように網膜を裏返し、5 mm x 5 mmの乾いた膜片を網膜の感光体側に置きます(図1F)。 濡れた絵筆の先端を2つの膜の間のスペースに触れ、毛細管現象を起こしてエイムをサンドイッチに吸い込みます(図1G)。これにより、網膜への膜の付着が減少し、網膜がデリケートなタスクワイプで過度に乾燥した場合にのみ必要です。注意: 網膜が光沢を失った場合は、過度に乾燥しているため、手順4.5が必要です。 均一な接着性を確保するには、濡れた絵筆で上膜に軽い下向きの圧力をかけます(図1H)。 1組の鉗子で下膜をガラスに固定しながら、ゆっくりと安定した動きで、2組目の鉗子で上膜をそっと剥がします。これにより、網膜がOPLのすぐ上で裂けます(図1I)。 光受容体を含む上膜を廃棄します(図1J、左)。下膜には内側の網膜があり、以下、裂網膜と呼ぶ(図1J、右)。 直ちに裂けた網膜をカーボゲン化エーム培地に戻す。注:生体組織での実験では、網膜は分割後のカルボゲン化エイムスで15〜30分の回復期間の恩恵を受ける可能性があります。 図1:網膜の分割手術 。 (A)冷たいPBSまたはAmes培地での眼球摘出および眼杯調製後、マウス網膜を眼杯から分離し、PBSを室温の炭酸添加Ames培地と交換します。(B)メスを使用して、内側にカールしている領域がなくなるまで網膜の端を切り取ります(オプション)。(C)メスを使って網膜を四分の一または半分に切ります。(D)カスタムトランスファーピペットを使用してスライドガラス(神経節細胞側を上にして)に網膜を1枚置き、デリケートなタスクワイプを使用して余分なエイムをすべて取り除きます。次のステップに進む前に、セミドライ網膜がガラスの上に平らに横たわっていることを確認してください。エイムズで濡らした絵筆の先端を使用して、網膜の平らでない領域をそっと広げます。(E)鉗子を使用して、事前にカットした乾燥ニトロセルロース膜(5 mm x 5 mm)を平らな網膜に置きます。(F)網膜の視細胞側が上を向くようにニトロセルロース片を裏返します。次に、別の乾いた膜を網膜に置きます。(G)ブラシの濡れた先端を2つの膜の間のスペースに触れ、毛細管現象を起こしてエイムズをサンドイッチに吸い込みます。これにより、網膜への膜の付着が減少し、網膜がデリケートなタスクワイプで過度に乾燥した場合にのみ必要です。(H)濡れた絵筆の先端を使用して、挟んだ網膜の中心を下向きにそっと押します。(I)1組の鉗子を使用して下部の膜をスライドガラスに固定し、もう1組の鉗子を使用して上部の膜を下部の膜からそっと剥がします。(J)内側の網膜(左)は下の膜に残り、視細胞(右)は上の膜で引き離されます。パネル(A)、(B)、(C)、(D)、および(J)は、解剖顕微鏡を使用して取得しました。スケールバーは約 1 mm を表します。パネル(E-I)は、拡大せずにスマートフォンのカメラで取得しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 5. 免疫蛍光実験のための割れ目網膜の作製 注:分割網膜は、ステップ5.5までニトロセルロースメンブレンに付着したままです。ステップ 5.1、5.2、5.3、5.4 のいずれかを実行しますが、これらは異なる実験用であるため、4 つすべてではありません。 注意: パラホルムアルデヒド(固定剤)を取り扱うときは、適切なPPEを使用し、慎重に進めてください。 フラットマウント免疫蛍光法の調製網膜を完全に覆うのに十分な溶液を使用して、分割網膜を氷上で4%パラホルムアルデヒドで30分間インキュベートします。 裂けた網膜を5〜10 mLの室温PBSで3回洗浄します。オプションの一時停止:裂けた網膜は、4°CのPBSに最大24時間放置することができます。 裂けた網膜の垂直切片による免疫蛍光法の調製網膜を完全に覆うのに十分な溶液を使用して、分割網膜を氷上で4%パラホルムアルデヒドで30分間インキュベートします。 裂けた網膜を5〜10 mLの室温PBSで3回洗浄します。オプションの一時停止:裂けた網膜は、4°CのPBSに最大24時間放置することができます。 メンブレンを付着したまま、分割網膜を10%、20%、30%のスクロースに4°Cでそれぞれ1時間順次浸漬し、組織を凍結保護します。 凍結保護された分割網膜を最適な切断温度(O.C.T.)コンパウンドに包埋し、凍結切片まで-80°C(最大6か月)で保存します。 埋め込まれた裂網膜を-80°Cから除去し、クライオスタットを使用して厚さ20μmの切片を切断します。切片を静電気を帯びたガラス顕微鏡スライドに取り付け、風乾させてから、-20°Cで最大6ヶ月間保管します。 二重蛍光 in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学の調製網膜を完全に覆うのに十分な溶液を使用して、分割網膜を4%パラホルムアルデヒドで氷上で2時間インキュベートします。 裂けた網膜を5〜10 mLの室温PBSで3回洗浄します。オプションの一時停止:裂けた網膜は、4°CのPBSに最大24時間放置することができます。 電気生理学の準備マイクロピペットプーラーを使用して、フィラメント付きの厚肉ホウケイ酸ガラスピペットを引っ張ってパッチピペットを調製します。測定抵抗が6〜10MΩのピペットのみを使用してください。 プルしたピペットを、125 K-グルコン酸、8 KCl、5 HEPES、1 MgCl 2、1 CaCl 2、0.2 EGTA、3 ATP-Mg、および0.5 GTP-Naを含む内部溶液(単位:mM)でバックフィルします。 ニトロセルロース膜からの裂けた網膜の除去疎水性バリアペンを使用して、顕微鏡スライド(直径~1cm)に円形のウェルを準備し、5〜10分間風乾させます。 準備した疎水性バリアペンウェル内に分割網膜を配置し、それらを完全に覆うのに十分なPBSを追加します。 解剖顕微鏡で、細い絵筆の毛を組織の端の下に押し込み、ゆっくりと上に持ち上げます。このようにして、網膜の周りを円を描くように動かして、網膜から持ち上げます。 鉗子を使用して、浮遊する網膜の下から膜を取り除きます。 網膜片が神経節細胞側を下にして顕微鏡スライド上に静止するように、残りのPBSを慎重に吸引します。メモ: 次の手順は、順番に実行しないでください。目的のアプリケーション(免疫染色または二重蛍光in situハイブリダイゼーション[FISH]および免疫組織化学[IHC]または電気生理学)に適したプロトコルを選択します。 6. 免疫染色 まだ準備していない場合は、疎水性バリアペンを使用して、顕微鏡スライド(直径~1cm)に円形のウェルを作成し、5〜10分間自然乾燥させます。すべてのインキュベーションステップと洗浄ステップは、これらのペンウェル内で実行されます。 網膜の分割または網膜の垂直分割切片を抗体インキュベーション溶液(AIS:3%ウマ血清、0.5%Triton X-100、0.025%NaN3 in PBS)で室温で30分間インキュベートします。 網膜の分割または垂直網膜の分割切片を、AISで希釈した一次抗体と室温で1時間インキュベートします。注:一次抗体のインキュベーション時間には、さまざまなタンパク質ターゲットと抗体の最適化が必要です。 ティッシュを室温PBSで3回洗浄します。 AISで希釈した二次抗体と組織を室温で1時間インキュベートします。ティッシュを室温PBSで3回洗浄します。 核染色が必要な場合は、PBSで希釈したDAPIで組織を室温で30秒間インキュベートします。ティッシュを室温PBSで1回洗浄します。 各ティッシュにスライド封入剤を一滴垂らし、ガラスカバーガラスを貼付します。 カバーガラスの端にマニキュアを塗って、サンプルを密封します。スライドは4°Cで保管してください。 7. デュアルFISHとIHC スプリット網膜を40°Cのハイブリダイゼーションオーブンで30分間焼き、スライドへの密着性を高めます。 RNAscope FISHプロトコルは、メーカーのプロトコルに従って完了しますが、以下の例外と変更があります。抗原賦活化ステップは必要ありません。プロテアーゼIIIは、室温で18分のインキュベーション時間で使用します。 疎水性バリアペンで作られたウェル内のスライドですべての洗浄手順を実行します。 サンプルをPBSで希釈した一次抗体( 材料表参照)中で、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで30分間インキュベートします。サンプルを室温PBSで3回洗浄します。 サンプルをPBSで希釈した二次抗体( 材料表を参照)中で、ハイブリダイゼーションオーブンで40°Cで30分間インキュベートします。サンプルを室温PBSで3回洗浄します。 サンプルを1x DAPIで室温で30秒間インキュベートします。サンプルを室温PBSで1回洗浄します。 ティッシュの各部分に褪色防止封入剤を一滴垂らし、ガラスカバーガラスを覆布します。 カバーガラスの端にマニキュアを塗って、サンプルを密封します。スライドは4°Cで保管してください。 8.電気生理学 ニトロセルロースメンブレンを取り外した後、分割された網膜をパッチクランプ記録チャンバーに移し、プラチナハープで静かに固定します。 実験全体を通して、95%O2 および5%CO2で炭化したエームス溶液で分割網膜を連続的に灌流します。溶液を32〜34°Cに維持します。注:実験中、組織はDodtグラジエントコントラスト顕微鏡を使用して視覚化できます。 室内照明の下で、セル全体の電圧クランプを実行して、INLニューロンから記録します。記録中に、マイクロセルラー注入ユニットを使用して医薬品化合物を塗布するか、チャネルロドプシン(ChR2)を刺激するために470 nm LEDを使用して光応答をシミュレートします。注意: 光強度は、デジタル光パワーメーターを使用して測定できます。 9. 共焦点顕微鏡 共焦点免疫蛍光法では、40倍/1.3倍または63倍/1.40の油浸対物レンズを使用して共焦点顕微鏡で画像を撮影します。FIJI を使用して、明るさとコントラストを調整し、イメージ スタックから Z 投影を生成します。